Name: improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

1. macromolecular hacinamiento en 2D Cultivos de Células de la piel <ol><li> 50.000 células de semillas (fibroblastos primarios o queratinocitos primarios o co-cultivo de fibroblastos y queratinocitos primarios) por pocillo de una placa de 24 pocillos. Sembrar las células en 1 ml de medio de crecimiento tipo de célula correspondiente. </li><li> Permitir que las células se adhieran durante la noche, en una incubadora de 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Desechar los viejos medios y reemplazar con 1 ml de...

<ol>
	<li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+skin:+unique+structures+with+diverse+functions.">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li><li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering.">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions/adherens+junctions:+basic+structure+and+function.">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li><li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules:+potential+targets+in+pharmacotherapy.">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li><li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteoglycans:+from+structural+compounds+to+signaling+molecules.">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li><li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and/or+exogenously+activated+keratinocytes.">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study.">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules:+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect.">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li><li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance.">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li><li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors:+when+less+might+be+more.">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA/DNA+and+DNA/RNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence.">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li><li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly:+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine.">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li><li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation.">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding.">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents.">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li><li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+skin+substitutes:+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications.">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production:+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models.">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior.">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies.">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729 (2015).</li><li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment.">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li><li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li><li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+More+Matrix:+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development,+using+macromolecular+crowding.">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li></ol>

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

La piel forma una barrera protectora mediante la prevención de la pérdida de agua y la entrada de patógenos. Se compone de tres componentes principales; la dermis ricos del estroma 1, una epidermis estratificada 2,3,4 encima de ella, y de la unión dermo-epidérmica de entre 5,6. La dermis se componen en gran parte de colágeno y fibras elásticas y está escasamente poblada con fibroblastos 7. En contraste, la epidermis rica en células se compone de varias capas de queratinocitos. Los queratinocitos de la capa más interna son proliferativa y proporcionan nuevas células basales que se renuevan y sustituyen a los queratinocitos de diferenciación terminal que se mueven constantemente a la capa más externa de la piel y han perdido sus núcleos y el material citoplasmática, lo que resulta en una capa córnea que se somete descamación. La unión dermoepidérmica, un tipo específico de la membrana basal, es una estructura compleja compuesta de moléculas de la matriz de interconexión, que tetheRS de la epidermis a la dermis. fibras de colágeno I de la dermis se entrelazan con las fibrillas de colágeno VII que se anclan en el colágeno IV densa rica lámina de anclaje. filamentos de anclaje (5 laminina, colágeno XVII y integrinas), a su vez conectan la lámina densa con hemidesmosomas de queratinocitos basales. queratinocitos basales (estrato basale) tienen la capacidad de proliferar y renovar, así como diferenciar y estratificar para formar las capas suprabasales; estrato espinoso, estrato granuloso, y, finalmente, el estrato córneo, que representa la superficie de contacto de la piel con el medio ambiente. En ruta desde la capa basal a la capa córnea, los queratinocitos cambian los patrones de expresión de citoqueratinas y finalmente se someten a apoptosis y encierran a sí mismos en cornified sobres, cascos de proteínas específicas que se reticulan covalentemente por la actividad de transglutaminasa. La recreación de la piel y sus capas in vitro, incluyendo las estructuras complejas de la<html> unión dermo-epidérmica y dérmica de la matriz extracelular, y emular el proceso de queratinización, tiene intrigado a los científicos durante mucho tiempo y bioingenieros como una tarea difícil. Ha habido avances significativos en la ingeniería de tejidos de la piel, por ejemplo, la extracción con éxito de células de la piel a partir de biopsias de pacientes y la generación de cultivos organotípicos piel utilizando células de la piel derivados del paciente 8. Sin embargo, permanecen sin resolver los problemas relativos a la pobre secreción de proteínas de matriz extracelular por las células de la piel a sí mismos y que resulta en modelos de piel sub-óptimos. Además, el tiempo requerido para generar la piel de co-cultivo organotípicos 3D utilizando los protocolos actuales varía entre cuatro a ocho semanas, un periodo de tiempo que potencialmente podría acortarse con la incorporación de Crowders macromoleculares. La reducción de tiempo de cultivo ahorra costes de reactivos, reduce la incidencia de la senescencia celular y reduce el tiempo de espera del paciente se debe utilizar el producto en la clínica. t &quot;&gt; Macromolecular hacinamiento (MMC) implica la introducción de macromoléculas específicas para el medio de cultivo para generar efectos de volumen excluido. Estos afectan a las tasas de reacción enzimática, incluyendo la escisión proteolítica de procolágeno que llega tarde bajo condiciones de cultivo estándar acuosas 9-13. Bajo MMC, reacciones enzimáticas se aceleró sin aumentar la cantidad de reactivos 14,15 resultantes en, en el caso de la escisión de procolágeno, un aumento de la cantidad de colágeno I moléculas en cultivos de hacinamiento, en comparación con los controles con poca gente 10. como la conversión de procolágeno a colágeno permite la formación de colágeno asambleas, los fibroblastos cultivados con MMC durante 48 horas produjeron significativamente más colágeno I en comparación con los cultivos de fibroblastos con poca gente supervisados ​​por hasta cuatro semanas 11,16,17. además de los efectos sobre las actividades enzimáticas que afectan a la formación, la estabilización y la remodelación de la MEC, MMC también se ha demostrado para mejorar directamente y modular colágenola formación de fibras 18,19. Presentamos aquí un método para mejorar la producción de la matriz extracelular (ECM) por células de la piel, en particular, fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos. Además, se muestra que la ECM enriquecido producido bajo MMC en monocapas se puede descelularizados y se utiliza como matriz derivada de células puro (CDM). Utilizamos un enfoque no convencional para visualizar y apreciar plenamente el ECM depositado por las células de piel cultivados con MMC. microscopía de interferencia de reflexión se utiliza normalmente para el estudio de las interacciones célula-matriz o puntos de contacto de célula a vidrio. Esta técnica se utilizó en nuestro sistema para ver la cantidad total de matriz depositada en la superficie de vidrio. microscopía de interferencia de reflexión se acopló con inmunotinción fluorescente para obtener la mayor cantidad de información en términos de composición de la matriz extracelular y el patrón, en presencia y ausencia de MMC. Organotypic piel co-cultivos es un método clásico para modelar la piel in vitro en un contexto tridimensional. Mientras bidimensionales co-cultivos pueden proporcionar información importante, es limitado en la traducción de estos datos y la aplicación de nuevo a un entorno in vivo, que es inherentemente una estructura tridimensional. queratinocitos de la piel, en particular, están polarizados y contienen segmentos apical y basal, que son esenciales para la homeostasis y la adhesión celular. Además, la expresión de proteínas típicas suprabasal en los queratinocitos por encima de la capa basal, tales como la queratina 1, la queratina 10 y filagrina sólo está presente en el curso de la estratificación y la diferenciación terminal de los queratinocitos. A medida que la diferenciación terminal apenas está presente en los cultivos típicos de una sola capa, la expresión de proteínas suprabasal normalmente no se logra en este sistema de cultivo. Por lo tanto, los cultivos organotípicos comienzan sumergidas en medio de cultivo, pero luego se levantan a una interfaz aire-líquido para conducir keratinocyte diferenciación. Esto resulta en la expresión de marcadores de estratificación, incluso cornificación y generalmente mejor reflexión de la fisiología epidérmica. Mientras que otros grupos han generado previamente la piel organotípicos co-cultivos con éxito, el establecimiento de una zona de unión dermo-epidérmica funcional ha sido un problema. A continuación, presentamos un nuevo método para cultivar piel organotípicos co-cultivos con una membrana basal mejorada, en un marco de tiempo condensado y sin comprometer la madurez de estas construcciones. Esto proporcionaría miméticos de la piel para el modelado in vitro, el estudio de la biología de la piel y una variedad de ensayos de cribado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:181px;">Wako</td>
			<td style="width:175px;">013-12061</td>
			<td style="width:499px;">Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture inserts&#160; (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:175px;">657610</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citrate solution</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">S2369</td>
			<td style="width:499px;">DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Collagen (rat tail)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">354236</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">CnT-57&#160;</td>
			<td style="width:181px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:175px;">CnT-57</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DAB Substrate + chromogen kit</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">K3468</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Deep-well plate (6-well format)</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">355467</td>
			<td>Organotypic cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">ECL detection reagent</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">RPN2106</td>
			<td>Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electron microscope (TEM)</td>
			<td>&#160;JEOL&#160;</td>
			<td>&#160;JEM-1010 (100kV)</td>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fibroblast media (FM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM70</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0310-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Ficoll PM400</td>
			<td style="width:181px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17-0300-05</td>
			<td>Macromolecular crowder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Keratinocyte serum-free media (KSFM)</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">17005-042</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">89900</td>
			<td style="width:499px;">Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">LSM510</td>
			<td style="width:499px;">Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Hydromount)</td>
			<td style="width:181px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:175px;">HS-106</td>
			<td>Fluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mounting media (Cytoseal)</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">8310-16</td>
			<td>Histology (HRP)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">OCT compound (Tissue Tek)</td>
			<td style="width:181px;">Sakura</td>
			<td style="width:175px;">4583</td>
			<td>Embedding for cryotomy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-streptomycin antibiotics</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A5955</td>
			<td>Cell culture media additive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen I antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Collagen Type IV</td>
			<td style="width:181px;">Novocastra</td>
			<td style="width:175px;">#NCL-COLL-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-collagen VII</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>LH7.2 (in house)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-Fibronectin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:175px;">#ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0009</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sample buffer</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">NP0008</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Secondary antibodies (Immunostaining)</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">#D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11037&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 594 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">&#160;#A-11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">AlexaFluor 488 goat-anti-mouse</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">#A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Secondary antibodies (HRP)</td>
			<td style="width:181px;">Dako</td>
			<td style="width:175px;">Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse</td>
			<td>undiluted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:181px;">Prodotti Chimicie Alimentari</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Decellularization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Stratification media</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ham&#8217;s F12&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10% fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">0.4mg/mL hydrocortisone&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL insulin</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">1.8&#183;10-4 M adenine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5mg/mL transferrin&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2&#183;10- 11 M triiodothyronine&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Trypsin</td>
			<td style="width:181px;">Biopolis Shared Facilities</td>
			<td style="width:175px;">0.125% Trypsin/Versene&#160;&#160; pH 7.0 + 0.3&#160;</td>
			<td>Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding

La familia de glicoproteínas de colágenos representa las principales proteínas estructurales en el cuerpo humano, y son componentes clave de los biomateriales utilizados en la ingeniería de tejidos moderna. Un cuello de botella técnico es la deposición de colágeno in vitro, ya que es notoriamente lentos, lo que resulta en la formación de sub-óptima de tejido conectivo y la cohesión del tejido posterior, particularmente en modelos de piel. A continuación, describimos un método que implica la adición de co-polímeros de sacarosa diferencialmente de tamaño a cultivos de piel para generar macromolecular hacinamiento (MMC), que se traduce en una mejora dramática de la deposición de colágeno. En particular, los fibroblastos dérmicos depositan una cantidad significativa de colágeno I / IV / VII y fibronectina bajo MMC en comparación con los controles. El protocolo también describe un método para decellularize capas de células de hacinamiento, la exposición de cantidades significativas de la matriz extracelular (ECM) que se conservaron en la superficie de cultivo como se evidencia por immunocytochemistry. patrón de masa total y la distribución de la matriz se estudió mediante microscopía de interferencia de reflexión. Curiosamente matrices, fibroblastos, queratinocitos y los co-cultivos producidos derivados de células (MDL) de diferente composición y morfología. MDL podría utilizarse como &quot;bio-andamios&quot; para la siembra celular secundaria, donde el uso actual de los revestimientos o andamios, por lo general de fuentes animales xenogénicas, se puede evitar, trasladando así a las aplicaciones más clínicamente relevante. Además, este protocolo describe la aplicación de MMC durante la fase sumergida de un modelo 3D-organotípicos piel de co-cultivo, que era suficiente para aumentar la deposición de ECM en la unión dermo-epidérmica (DEJ), en particular, el colágeno VII, el componente principal de fibrillas de anclaje. La microscopía electrónica confirmó la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos desarrollados con MMC, en comparación con los controles. Esto es significativo ya que las fibrillas de anclaje atar el dermis a la epidermis, por lo tanto,que tiene un pre-formada madura DEJ puede beneficiar a los receptores de injertos de piel en cuanto a la estabilidad del injerto y la curación de heridas en general. Además, el tiempo de cultivo se condensa a partir de 5 semanas a 3 semanas para obtener una construcción madura, al utilizar MMC, reduciendo los costos.

Aglomeración macromolecular fue capaz de mejorar la deposición de ECM, en particular, los fibroblastos depositan más colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los cultivos control (figura 1, la capa de células; 1A, colágeno I; 1B, colágeno IV; 1C, fibronectina). Tras la descelularización, era evidente que los fibroblastos fueron los principales depositantes de colágeno I, IV y fibronectina en comparació...

Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Se presenta un protocolo para obtener matrices derivadas de células ricas en proteínas de la matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Además, se presenta un protocolo que incorpora MMC en 3D generación de la piel de co-cultivo organotípicos, lo que reduce el tiempo de cultivo, manteniendo la madurez del constructo.

La mejora en 2D y 3D de la piel<em&gt; In Vitro</em&gt; Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Investigación

Bioingeniería

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...