Name: flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.

Achtung: Einige Chemikalien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind Reizstoffe und sind im Falle von Hautkontakt gefährlich. Wenden Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung vor dem Durchführen dieses Protokoll. Die in Schritt (1.1.1) verwendet Piranha-Lösung ist stark ätzend und erfolgt durch Zugabe der Peroxid langsam zu der Säure unter Rühren hergestellt werden. Behandeln Sie diese Lösung mit äußerster Vorsicht in einer Abzugshaube. Verwenden Sie geei...

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	<li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays.">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li><li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology.">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li><li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems.">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8(+)+T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria.">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells.">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li><li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions.">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells.">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li><li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells.">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499 (2014).</li><li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density,+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications.">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications.">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li><li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-encoded+antibody+libraries:+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins.">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li><li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+protein-protein+cross-linking.">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li><li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density,+microfluidics-based+DNA+microarrays,+with+applications+to+single+cell,+multiplex+assays+of+secreted+proteins.">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).</li></ol>

Strömungsmuster Design ist der erste wichtige Schritt bei der Herstellung der 2-D-Mikroarray. Um zwei überlappende DNA-Muster auf einem Glassubstrat zu erzeugen, müssen die Kanal Merkmale des ersten Design senkrecht zu denen des zweiten (1A-B). Die Entwürfe beachten Sie auch die nachgelagerten Anwendungen des Mikroarrays. Im Fall der Einzelzellanalyse wird der Mikroarray verwendet werden, um Proteine, die von einzelnen Zellen in Mikrokammern umschlossen erfassen, damit die Kanalabmessungen ...

Antikörper-Mikroarrays wurden weitgehend in der Proteomik seit Jahrzehnten verwendet, um die Anwesenheit von Zielproteinen, einschließlich Proteinbiomarker 1-3 zu prüfen. Obwohl dieser Bereich steht derzeit vor großen Herausforderungen von anderen Hochdurchsatz-Technologien wie Massenspektrometrie (MS), gibt es noch viel Raum für die Nützlichkeit der Antikörper Microarrays, vor allem, weil diese Geräte leisten einfache Dateninterpretation und einfache Schnittstelle mit anderen Tests. In den letzten Jahren hat sich die Integration von Microarrays in die Mikrochip-Gerüsten der Antikörper Microarray eine neue Möglichkeit, gedeihen 4-7 vorgesehen. Zum Beispiel hat der Barcode Microarray in eine Einzelzellmikrochip integriert in Zell-Kommunikation Studien 8,9 verwendet. Diese Technologie hat deutliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Microarray-Technologien. Es verfügt über Array-Elemente auf 10-100 um, viel kleiner als die typischen 150 um Größe in herkömmlichen Microarray elemen verwendetts. Der Bau von kleineren Arrayelemente mit systematischen Strömungsmusterbildungsverfahren erreicht wird, und dies führt zu kompakten Mikroarrays, die Einzelzell sezernierten Proteinen und intrazellulären Proteinen erkennen kann. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung eines einfachen, instrument freie Konfiguration. Dies ist besonders wichtig, weil die meisten Labors und Kleinunternehmen nicht in der Lage, um Mikroarray-Kerneinrichtungen zugreifen zu können. Solchen Barcode-Antikörper-Mikroarrays mit einer leistungsfähigen Assay Durchsatz und können verwendet werden, um hoch Multiplex-Assays an einzelnen Zellen durchzuführen, während eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität mit der von herkömmlichen Sandwich-Enzym-Immunoassay (ELISA 8) werden. Diese Technologie hat zahlreiche Anwendungen in der Detektion von Proteinen aus Glioblastom 9-11, T-Zellen 12 und 13 zirkulierenden Tumorzellen gefunden. Alternativ Barcode DNA Microarrays allein in der präzisen Positionierung von Neuronen und Astrozyten für mimick genutzt wordening der in vivo Anordnung von Hirngewebe 14. Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die experimentellen Schritte und Aufbaublöcke der zweidimensionalen (2D) Strichcode-Antikörper-Microarray, die Anwendungsmöglichkeiten in der Detektion von Biomarkern in Fluidproben hat und in einzelne Zellen. Die Technik basiert auf einem adressierbaren einzelsträngig, eindimensionale (1-D) DNA Microarray konstruiert unter Verwendung eines Orthogonal-Oligonukleotide, die sich räumlich auf Glassubstraten gemustert. Der 1-D-Muster gebildet wird, wenn parallele Strömungskanäle in Strömungsmusterungsschritt verwendet, und ein derartiges Muster wird als diskrete Banden visuell ähnlich zu 1-D Universal Product Code (UPC) Barcodes. Der Bau eines 2-D (n x m) Antikörper Array - erinnert an ein 2-D Quick Response (QR) Matrixcode - braucht mehr komplexe Strukturierungsstrategien, sondern ermöglicht für die Immobilisierung von Antikörpern mit einer höheren Dichte 8,15. Die Fertigungerfordert zwei DNA Strukturierungsschritte, wobei das erste Muster senkrecht zu der zweiten. Die Schnittpunkte dieser beiden Muster bilden die n x m Elemente des Arrays. Durch strategische Auswahl der Sequenzen der einzelsträngigen DNA (ssDNA) in Strömungsstrukturierung verwendet wird, wird jedes Element in einem gegebenen Array eine bestimmte Adresse zugewiesen. Diese Raumbezug ist bei der Unterscheidung zwischen Fluoreszenzsignale auf dem Microarray Objektträger notwendig. Die ssDNA-Array in einen Antikörper-Array durch den Einbau von komplementären DNA-Antikörper-Konjugate umgewandelt und bildet eine Plattform genannte DNA-kodierten Antikörperbibliothek (DEAL 16). Diese Video-Protokoll werden die wichtigsten Schritte bei der Erstellung nxm Antikörperarrays, umfassend die Herstellung schließen Polydimethylsiloxan (PDMS) Barcode Formen, Fließmuster ssDNA in zwei Orientierungen, die Vorbereitung Antikörper-Oligonukleotid-Konjugaten DEAL, und Umwandeln des 3 x 3-DNA-Array in ein 3x 3-Antikörper-Array.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard 184 silicone elastomer base</td>
			<td style="width:403px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">3097366-1004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:263px;">Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td style="width:403px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">SU-8 2025 photoresist</td>
			<td style="width:403px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">Y111069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Silicon wafers&#160;</td>
			<td style="width:403px;">University Wafers</td>
			<td style="width:119px;">452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Poly-L-lysine coated glass slides</td>
			<td style="width:403px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C40-5257-M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:403px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Poly-L-lysine adhesive stock solution</td>
			<td style="width:403px;">Newcomer Supply</td>
			<td style="width:119px;">1339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&#160; (BS3)</td>
			<td style="width:403px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1x Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:403px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:119px;">114-058-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:263px;">&#196;kta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System</td>
			<td style="width:403px;">GE (Amersham Pharmacia)&#160;</td>
			<td>18-1112-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Superose 6 10/300 GL column</td>
			<td style="width:403px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Capture antibodies</td>
			<td style="width:403px;">various</td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td>*Antibody selection depends on application</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:263px;">Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td>
			<td style="width:403px;">Solulink</td>
			<td style="width:119px;">S-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td>
			<td style="width:403px;">Solulink</td>
			<td style="width:119px;">S-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">N,N-dimethylformamide</td>
			<td style="width:403px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Citric acid, anhydrous</td>
			<td style="width:403px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">42356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:403px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO</td>
			<td style="width:403px;">EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spin coater</td>
			<td style="width:403px;">Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650-MZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter)</td>
			<td style="width:403px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond scribe (Style 60)</td>
			<td style="width:403px;">SPI supplies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:403px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">92361</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

Die Entwürfe für die PDMS-Form (1A-1B) wurden unter Verwendung eines CAD-Programms (AutoCAD) erstellt. Zwei Entwürfe gezeigt Funktion Kanäle für Strömungs Strukturierung, eine horizontale und eine vertikale. Die linke und rechte Teile jedes Design symmetrisch sind; einer von ihnen könnte Einlässen oder Auslässen sein. Jeder der 20 Kanäle ist Wicklung von einem Ende hin zum anderen Ende. Jedes Design ist auf einem Chrom-Photomaske (Abbildung 1c)...

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Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

Research

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Chemistry

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

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Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

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Chemie

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

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Herstellung von großflächigen Freistehende ultradünne Polymerfilme

This procedure describes a method for the fabrication of large-area and ultrathin free-standing polymer films.  Typically, ultrathin films are prepared ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

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Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

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Einfluss von Hybrid Perowskit-Herstellungsverfahren auf Filmbildung, Elektronische Struktur und Leistung der Solarzelle

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