Name: development and validation of a quantitative pcr method for equid herpesvirus-2 diagnostics in respiratory fluids
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00
Duration: 9 min 57 s
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The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.

<ol>
	<li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness.">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li><li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+gammaherpesviruses:+pathogenesis,+epidemiology+and+diagnosis.">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li><li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+(EHV-2,+EHV-5)+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method.">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li><li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+(EHV-1)+and+equid+herpesvirus+4+(EHV-4).">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li><li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis:+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease.">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li><li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro:+the+polymerase+chain+reaction.">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li><li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).</li><li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses.">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li><li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids:+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007.">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li><li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals.">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li><li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).</li><li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).</li><li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , (2009).</li><li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children's+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR.">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. 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Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).</li><li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies.">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li><li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method.">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li></ol>

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

2000 के दशक के बाद से, वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगशालाओं के एक बढ़ती हुई संख्या में सोने के मानक तकनीक (सेल संस्कृति और बैक्टीरिया संस्कृति तरीकों) की जगह दी गई है। तकनीक के कार्यान्वयन अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि प्रयोगशाला तरीकों का सत्यापन, सटीक repeatable और विश्वसनीय आंकड़े सुनिश्चित करने के लिए आणविक पता लगाने और रोगाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है। चूंकि निष्कर्षण कदम जैविक सामग्री के नुकसान का प्राथमिक स्रोत है, यह एक प्रोटोकॉल और एक अन्य के बीच मात्रा का ठहराव की त्रुटि का मुख्य स्रोत माना जा सकता है। जैसे, QRT- पीसीआर के दौरान डीएनए प्लाज्मिड के एक मानक वक्र, मुख्य रूप से साहित्य में सूचना के सृजन, वायरल जीनोम लोड संकेत है, लेकिन निकासी कदम खाते में नहीं ले करता है। AFNOR आदर्श एनएफ U47-600-2 में एक पूरे विधि सत्यापन प्रक्रिया के लिए एक नए सिरे से रणनीति का विवरण इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। में सचित्र के रूप मेंEHV-2 घोड़ों में इस कागज, या मधुमक्खियों 21 में दूसरों के द्वारा, इस विकास कदम और पीसीआर के लक्षण वर्णन और पूरे विधि के लक्षण वर्णन के साथ सत्यापन के कदम के बीच स्पष्ट भेदभाव जरूरी है। इस दिलचस्प दृष्टिकोण में एक सीमा है कि प्रोटोकॉल में कोई बदलाव दायित्व पूरी प्रक्रिया है जो बहुत महंगा हो सकता है revalidate करने में परिणाम होगा। यह सीमा भी सच है कि मात्रा का ठहराव के दायरे स्रोत है जो वायरस से निकाला जाता है (उदाहरण के लिए, श्वसन तरल पदार्थ, अंगों, खून या मूत्र) पर निर्भर द्वारा डाला गया था। वास्तव में, प्रत्येक मैट्रिक्स उनकी भौतिक-रसायन विज्ञान विशेषताओं में विभिन्न विशिष्टताओं प्रस्तुत करता है और यह स्वतंत्र रूप से एक अलग वायरल का पता लगाने और QRT- पीसीआर द्वारा मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया मैट्रिक्स को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, प्रत्येक जैविक नमूने के वायरल जीनोम लोड निकासी से अधिक ठीक मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। लक्षण वर्णन भी खाते thermocycler आधुनिक में ले जाता हैएल और जब एक पहले से अच्छी तरह से विशेषता विधि के प्रयोग (जैसे, EHV-2 qPCR विधि इस पत्र में वर्णित) मूल प्रयोगशाला से या किसी अन्य प्रयोगशाला में मशीन के एक नए प्रकार जरूरी है, एक है कि साधन के प्रदर्शन की पुष्टि करनी होगी। एक qPCR परख के प्रदर्शन की पुष्टि के लिए एक शर्त के लिए सभी परीक्षण एक प्रयोगशाला में लाना है। यह सामान्य रूप में जाना जाता गुणों के साथ एक संदर्भ नमूना विश्लेषण करके हासिल की है। इस तरह की एक जाँच के लिए एक शर्त और अनिवार्य माना जाता है के रूप में आदेश qPCR (लोद, LOQ दक्षता) के प्रदर्शन और पूरे विधि (लोद, LOQ) की मजबूती को मान्य करने में एनएफ 47-600-1 AFNOR के आदर्श से अनुरोध किया है। न केवल विकास और लक्षण चरणों के दौरान भी है लेकिन जब अनुसंधान के क्षेत्र में या नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है, जोखिम कारकों की पहचान की जा सकती है और अच्छी तरह से प्रोटोकॉल का मानकीकरण सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया। विशेष चिंता की पर्याप्त कर्मचारियों के प्रशिक्षण, उच्च योग्य कर्मियों, उपभोग्य सामग्रियों की गुणवत्ता नियंत्रण हैइस्तेमाल किया और उनके भंडारण, तत्काल पर्यावरण की स्थिति और metrological की स्थिति के बारे में जागरूकता है कि वैज्ञानिक परख में शामिल उपकरणों के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता का नियंत्रण। अंतर-प्रयोगशाला तुलना के लिए संदर्भ के नमूने का उपयोग भी अनिश्चितताओं नियंत्रित करने में मदद कर सकता है। इस तरीके में, प्रयोगशालाओं के बीच डेटा की तुलना की जा सकती है। दरअसल, अंतर-प्रयोगशाला दक्षता परीक्षण का मूल्यांकन करने और विधि के reproducibility पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं। वायरल जीनोम लोड परिणामों का विश्लेषण किया जो जैविक मैट्रिक्स के अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आइयू) में व्यक्त कर रहे हैं (आइयू: तरल पदार्थ या प्रतियों के लिए प्रतियां / एमएल ऊतकों के लिए / छ) के क्रम में विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं। LOQ ऊपर सभी परिणाम एक गैर मात्रात्मक सकारात्मक परिणाम के रूप में लिया जाता है प्रतियां / एमएल और लोद और LOQ के बीच एक परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। इस तरह से जीनोम के quantificational आंकड़े पेश की प्रक्रिया को और अधिक ठीक अनुरूप हैविश्लेषण के एस (जीनोम के प्रवर्धन)। वास्तव में, सेल संस्कृति प्रयोगों में, TCID 50 से वायरल लोड की अभिव्यक्ति (मंझला टिशू कल्चर संक्रामक खुराक) कोशिकाओं और वायरस उपभेदों की प्रकृति पर निर्भर है। प्रत्येक तनाव लाइन के पास अपनी अनूठी संक्रमण कैनेटीक्स और EHV-2 की तरह कुछ वायरस कई दिन लग सकते हैं इससे पहले पहली कोशिकाविकृतिजनक प्रभाव स्पष्ट है। अंत में, QRT- पीसीआर के लक्षण वर्णन की इस नई विधि डेटा प्रस्तुति और प्रयोगशालाओं के बीच व्याख्या के अनुरूप सुविधा चाहिए। यह संभावित नए उपस्थिति या रोगज़नक़ के अभाव के बजाय केवल रोग की स्थिति की घोषणा के लिए कट-ऑफ मूल्य की स्थापना की तरह भविष्य में QRT- पीसीआर के अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा।

Equid herpesvirus -2 (EHV-2) इस तरह के नाक मुक्ति, ग्रसनीशोथ और सूजन लिम्फ नोड्स 1-3 के रूप में संभावित नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ के साथ, एक रेस्पिरेटरी सिंड्रोम में शामिल है। यह वायरस भी घोड़ों की गरीब प्रदर्शन है, जो घोड़ा 2 उद्योग के लिए एक महत्वपूर्ण और नकारात्मक आर्थिक प्रभाव में हो सकता है के साथ जुड़े होने का संदेह है। अब तक, गामा-EHV के लिए स्वर्ण मानक (γ-EHV) का पता लगाने सेल संस्कृति तरीका था। इस प्रक्रिया के पहले असुविधा EHV-2 और अन्य के बीच भेदभाव का अभाव था γ-EHV के (जैसे, EHV-5)। दूसरी असुविधा cytopathic प्रक्रिया है, जो 4,5 प्रकट करने के लिए 12 से 28 दिनों से लेता है की धीमी गति से विकास किया गया। एक मान्य है और सामान्यीकृत मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का विकास (QRT- पीसीआर) विधि तेजी से वायरस का पता लगाने के लिए, EHV -2 और EHV- के बीच भेदभाव करने में मदद मिलेगी5 और वायरल जीनोम लोड और मात्रा का ठहराव पहलू को रोग धन्यवाद बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) Mullis 6 द्वारा 1986 में पहली बार के लिए वर्णित किया गया था और के बारे में जैविक निदान (मानव, पर्यावरण और पशु चिकित्सा) के क्षेत्र के अधिकांश में नए सोने के मानक बन गया है। विशिष्टता, संवेदनशीलता और तेज़ी: इस विधि है, जो रोगाणुओं की जीनोम का एक हिस्सा के प्रवर्धन पर आधारित है, कई फायदे प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, amplicon संक्रमण के जोखिम को QRT- पीसीआर के आगमन और गुणवत्ता आश्वासन के बाद 7 सिकुड़। फिर भी, एक नया स्वर्ण मानक पद्धति के रूप में पीसीआर की मान्यता सिर्फ बेहतर प्रदर्शन डेटा लेकिन यह भी समय के साथ प्रदर्शन की गिरावट के बिना पूरे विधि के विकास और सत्यापन के कदम के नियंत्रण के प्रदर्शन से भी अधिक जरूरी हो। पहले आणविक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल उपकरण EHV -2 थे समय गनेस्टेड पीसीआर के साथ onsuming और इसमें शामिल गैर विशिष्ट प्रवर्धन अनुक्रमण 8 द्वारा पीछा किया। दाद वायरस के लिए लक्षित जीन deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) पोलीमर्स और डीएनए पैकेजिंग 9 थे। हालांकि, नेस्टेड पीसीआर amplicons द्वारा संदूषण के एक उच्च जोखिम प्रस्तुत करता है। तब से, पारंपरिक पीसीआर परीक्षण इंटरल्यूकिन 10-जैसे जीन या ग्लाइकोप्रोटीन बी जीन, 2009 2 में समीक्षा बढ़ाना करने के लिए डिजाइन किया गया है। हाल ही में, वास्तविक समय पीसीआर विशेषताओं EHV-2 10 की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित किया गया लेकिन कोई डेटा उपलब्ध थे निकासी की प्रक्रिया सहित पूरे विधि के सत्यापन के विषय में। इस प्रोटोकॉल में, विकास और सत्यापन प्रक्रियाओं घोड़े का श्वसन तरल पदार्थ में पता लगाने और एसोसिएशन Française de सामान्य बनाने के अनुसार EHV-2 डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के लिए वर्णित हैं (AFNOR) के आदर्श एनएफ U47-600 3,11,12, जिसमें फ्रेंच प्रतिनिधि हैअंतरराष्ट्रीय सामान्य बनाने समिति। यह आदर्श विवरण &quot;आवश्यकताओं और कार्यान्वयन, विकास और पशुओं के स्वास्थ्य विश्लेषण विधि में पशु चिकित्सा पीसीआर के सत्यापन के लिए सिफारिशें&quot; 11,12, एनएफ एन आईएसओ / CEI 17025, 2005 से 13 और OIE (पशु स्वास्थ्य के लिए विश्व संगठन) के अनुसार । (क) QRT- पीसीआर परख के विकास, (ख) QRT- पीसीआर परख के अकेले लक्षण और (ग) पूरे के लक्षण वर्णन: सिफारिशों, 2010 14 EHV-2 QRT- पीसीआर सत्यापन प्रोटोकॉल एक तीन भाग प्रक्रिया शामिल विश्लेषणात्मक विधि (पीसीआर विश्लेषण करने के लिए जैविक नमूने से न्यूक्लिक एसिड की निकासी से)। पता लगाने (लोद) की सीमा और मात्रा का ठहराव की सीमा (LOQ): QRT- पीसीआर परख की और पूरे विश्लेषणात्मक विधि के लक्षण वर्णन के दो सीमाओं की परिभाषा में शामिल हैं। लोद 95% पीसीआर मात्रा प्रति इकाई न्यूक्लिक एसिड प्रतियां कि सभी कैस के 95% में पता लगाया जा सकता है की सबसे कम संख्या का प्रतिनिधित्व करता हैतों। LOQ 95% पीसीआर न्यूक्लिक एसिड प्रतियां कि खाते में अनिश्चितताओं लेने से निर्धारित किया जा सकता का सबसे कम मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। इस QRT- पीसीआर विधि सटीक पता लगाने और सांस तरल पदार्थ में EHV-2 के तेजी से मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा, विधि एक मानकीकृत प्रक्रिया और अन्य नए QRT- पीसीआर assays के विकास के लिए सामान्य रूप में टेम्पलेट सुनिश्चित करने के लिए अन्य प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AB-1900 natural color ABgene 96 well plate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">16924</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Adhesive film QPCR Absolute&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">16629</td>
			<td style="width:196px;">Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.5 mL microtubes, skirted, caps</td>
			<td style="width:145px;">Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">039258</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol 98%</td>
			<td style="width:145px;">Sodipro</td>
			<td style="width:119px;">SAF322941000</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td>Custom order</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Probe</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td>Custom order</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td>Custom order</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">QIAamp&#160; RNA viral Mini Kit 
			(containing: QIAamp Mini column, AVL&#160; buffer,&#160; AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes)&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">52906</td>
			<td style="width:196px;">AVL buffer: pre-warm 5 min at 72&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sequencing by Sanger method</td>
			<td style="width:145px;">Eurofins</td>
			<td>Custom order</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Taqman Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">4364340</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td style="width:145px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-296653A</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-Time PCR systems</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">4376600</td>
			<td style="width:196px;">pre-warm 15 min&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of a quantitative pcr method for equid herpesvirus-2 diagnostics in respiratory fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

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Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

विकास और श्वसन तरल पदार्थ में Equid herpesvirus -2 निदान के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के मान्यकरण

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A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Aerosolized lipopolysaccharide का प्रयोग उत्पन्न पल्मोनरी Neutrophilia के लिए एक विधि

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

टी सेल रिसेप्टर छांटना सर्किलों के एक साथ मात्रा (TRECs) और कश्मीर हटाने पुनर्संयोजन छांटना हलकों (KRECs) वास्तविक समय पीसीआर द्वारा

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilm विकास पर थूक के प्रभाव Visualizing एक संभाग coverglass मॉडल का उपयोग

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

एक उपंयास के साथ ANA स्क्रीनिंग के दौरान Monospecific और मिश्रित DFS70 पैटर्न के एक साथ भेद एेसी-2 अभिजात वर्ग/DFS70 पीटा सब्सट्रेट

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

विकास और एक Ultrasensitive एकल अणु सरणी डिजिटल एंजाइम के सत्यापन-मानव इंटरफेरॉन के लिए Immunosorbent परख से जुड़े-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...