Name: isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00
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이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) MGC에 R01-NS074387, R01-NS057711 및 R21-NS091555 부여의 / 국립 연구소 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; NIH / NINDS는 PRL에 R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 및 R21-NS084275을 부여; 레아의 행복한 마음에서 보조금, MGC 및 PRL에게 수여 미시간 종합 암 센터의 대학; 신경 외과, 의학 미시간 대학의 대학의 부; NIH 보조금 2UL1-TR000433 지원하는 임상에 대한 미시간 연구소 및 건강 연구,; NIH / NCI (국립 암 연구소) 부여 T32-CA009676에 의해 지원되는 미시간 대학 암 생물학 교육 보조금; NIH / NINDS 지원하는 임상과 기초 신경 과학 미시간 교육 대학은 T32-NS007222을 부여; 그리고 NIH / NIGMS (일반 의학 과학의 국립 연구소)에 의해 지원 미시간 의료 과학자 교육 프로그램의 대학은 T32-GM007863을 부여합니다. 저자박사 카린 Muraszko 및 신경 외과의 부서에서받은 교육 리더십과 지원에 감사 재; M. 달 그렌, D. Tomford,과 최상의 행정 지원에 대한 S. 나폴리탄에; 뛰어난 기술 지원 M. Dzaman에; 그리고 자이스 3D 스캐닝 전자 현미경의 구입을 향해 관대 한 지원을위한 필 F. 젠킨스에. 우리는 또한 뇌 단핵 세포의 분리를위한 밀도 원심 분리 미디어 매개 전략의 수정 된 버전이 그려진하는 하버드 의과 대학에서 Kuchroo 실험실을 인정합니다.

참고 : 실험을 수행하기 전에 전체 프로토콜을 검토하십시오. 동물의 사용과 복지의 해당 기관위원회에서 척추 동물의 사용에 대한 승인은 진행하기 전에 취득해야합니다. 두개 내 생착에 대한 종양 세포의 1. 준비 <ol><li> 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 작동하는 (10 % 멸균 여과 열 활성화 된 우 태아 혈청으로 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)의 500ml의 병을 보충하여 GL26-CI...

<ol>
	<li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma.">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Ostrom, Q. 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이 프로토콜은 초기 마우스 뇌 종양 미세 환경에 침투 한 한 PBMC의 분리 및 유세포 분석을위한 견고하고 재생 가능한 방법을 설명한다. 신경 교종 세포 현탁액 정위 마우스 뇌의 선조체에 접목 된 실험자에 의해 지정된 농도로 생성된다. 마우스는 다음 실험 디자인에 의해 지정된 소정의 시점에서 안락사 그들의 뇌를 수거하고, 형광 접합 된 일차 항체의 조합으로되어 immunolabeled 교종 함침 한 PBMC?...

신경 교종은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는 변형 신경교 neuroepithelial 뇌암의 클래스이다. 모든 신경 교종의, 세계 보건기구 (WHO) 등급 IV 신경 교종, 또는 아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 1 치명적이다. GBM은 테모 졸로 마이드 2 방사선 플러스 수반과 보조 화학 요법 다음에 가능한 범위에 종양 절제술로 구성되어 현재의 표준 진료에 매우 내화입니다. 이 치명적인 암 5 년 3 후에 질병을 생존 환자의 5 %와 초기 진단의 시간에서 생존의 15-18개월의 실력 예후를 수행한다. 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재는, 전문적인 항원 제시 세포의 부족 (장갑차) 및 뇌 내에서 4 선의 림프 구조의 존재는 이전 미확인 특권 면역 GBM의 개념을 이끌어왔다. 그러나, 많은 연구가 지금 SHO이러한 뇌 암은 참으로 단핵구, 대 식세포 및 골수 유래 억제 세포 (MDSCs) (5)를 포함 기원에 주로 골수 있습니다 주변 면역 세포의 채용을 발생시킬 것을 승. GBM은 6,7 프로 종양 될 뇌 상주 미세 아교 세포의 활동에 영향을 미친다. 이러한 CD8 + T 세포 (8)과 CD56 + 자연 살해 세포 (9) 등의 림프 세포는 종양 미세 환경 내 존재하지만 훨씬 적은 숫자 생각 사실 (인해 종양 연관된 대 식세포에 신경 교종 - 유래 요인에 의해 유발 면역 기능 할 TAMS) 10. CD4 + T 세포는 GBM도 존재하지만이 인구의 대부분은 CD25 및 Foxp3를, 면역 T 규제 (T의 REG) 셀 (11)의 업체를 표현한다. GBM의 전반적인 면역 억제 상태는 면역 탈출 및 종양 진행 (12)의 증진에 절정. 13-19을 개발하기 위해 뇌 종양 immunosuppresson의 메커니즘을 극복하기 위해 노력하고있다. 이 작품의 절정은 이제 새로 진단 GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov 식별자) 환자 결합 된 세포 독성 및 면역 자극 치료를 평가하기위한 임상 시험을 주도하고있다. 가장 최근의 연구는 마우스 GL26 쥐 CNS -1- GBM 셀 β - 갈 락토 시드 - 결합 렉틴 ​​galectin-1 (GAL-1) ~ (20)의 대량 생산함으로써 항암 NK 세포의 면역 감시를 차단하는 것으로 나타났다. 이것은 shRNA를 매개 유전자 녹다운을 사용하여 신경 교종 세포의 GAL-1의 발현을 억제함으로써 입증되었다. 시험 관내 experimenTS는 GAL-1 결핍 신경 교종 세포 배양에 정상적으로 증식 것으로 나타났다, 아직 동계 C57BL / 6J 또는 RAG1에 두개 내 생착 후 곧 빠른 거절을 시행 - / - 마우스, 따라서 이러한 형태에 T- 또는 B- 세포의 독립성을 확립 종양 제거. 안티 아시 알로 GM 1 항혈청 또는 GAL-1 결핍 신경 교종 제거에서 NK 세포의 역할을 설정하는 두개 GAL-1 결핍 교종 성장의 완전한 회복되었다 모노클 NK1.1 항체와 NK 세포 immunodepletion. 우리는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 immunodepletion 표시하는 따라서 NK 매개 GAL의 돕는데 골수 세포를위한 필수 불가결 한 보조 역할을 드러내는, NK 세포의 존재에도 불구하고 GAL-1 결핍 신경 교종 제거를 방지하기에 충분한 -1 결핍 종양 용해 (게시되지 않은 데이터). 이는 예기치 않은 결과는 말초 혈 단핵 세포의 분리 및 분석 (한 PBMC)를위한 광범위한 프로토콜을 개발할 주도했음을우리는 더 나은 GAL-1 결핍 신경 교종 거부 조건부 면역 침투 이벤트를 특성화 할 수 있도록 즉시 두개 내 생착 후 뇌 종양 미세 환경에 침투. 방법은 GL26-CIT를 불리는 구조적 익스프레스 mCitrine 형광 단백질은, 형광 현미경 (21)에 의해 직접 종양 세포의 가시화를 허용 GL26 마우스의 신경 교종 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 이 세포들은 정위 동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접목하고, 이전에 마우스 안락사에 24, 48, 또는 72 시간 동안 성장을 사용할 수 있습니다. 신경 교종-침투 PBMC를 다음 항 -CD45를 사용하여 격리 및 immunolabeled되어, -GR-1, -CD11b과 그랜 자임 B의 세포 내 immunolabeling와 함께 -NK1.1 세포 표면 항체 (GzmB). 항체의 이러한 특정 조합이 우리가 B가 종양 침윤 GR-1 + / + CD11b를 골수 세포의 식별 및 NK1.1 +, NK 세포, 세포 유형을 허용EEN는 GAL-1 결핍 종양 제거에 관여. GAL-1 결핍 GL26-CIT의 신경 교종의 면역 침투 프로파일, GL26-CIT의-gal1i 여기에 언급하고 비를 포함 GAL-1 GL26-CIT의-NT 호출의 정상 수준을 발현하는 신경 교종의 것과 비교된다 제어 shRNA를 머리핀을 대상으로. 프로토콜 동소 동계 C57BL / 6J 마우스의 선조체로 이들 세포를 접목하는 방법에 대한 설명이 뒤 따른다 시험 관내 배양 방법 GL26-CIT의 신경 교종 세포에 대한 설명으로 시작한다. 그러므로 분리 및 유세포 분석 교종 함침 된 PBMC의 immunolabeling 관련된 단계를 열거 진행한다. 표준 프로토콜은 데이터 분석 및 그래픽 표현의 설명으로 종결. 데모는 밝혀 그 모두 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포와 NK1.1 + NK 세포 우선적으로 48 내 여자-1 결핍 뇌 종양 미세 환경 내에서 축적종양 주입,이 종양이 빠른 속도로 완전한 종양 용해 약 일주 후 종양 생착 (20)를 받아야하는 이유를 설명하는 데 도움이되는 결과의 시간. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 다양한 실험 디자인에 용이하게 적응할 수있다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출로부터 프로토콜을 수행 할 수있다. 방법은 또한 특히 종양 미세 환경에 의해 유도 된 면역 표현형을 식별하도록 뇌 침투 것들과의 비교를 위해 종양 함유 마우스에서 PBMC를 순환 프로파일을 특성화하기 위해 실험 목적과 결합 될 수있다. 이것과 유사한 방법을 적용 뇌 종양 미세 환경 내로 말초 면역 세포의 거래에 관련된 요인의 더 나은 이해를 용이하게한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

우리 연구소는 최근 자연 살해 (NK) 세포가 암 세포가 β - 갈 락토 - 결합 렉틴 galectin의 발현에 결함이 렌더링되는 경우 두개 내 생착 후 CNS-1 악성 신경 교종 곧 동소 이식 마우스 GL26과 쥐를 박멸 할 수 있음을 보여 주었다 -1 (GAL-1). 최근의 연구는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 인구는이 효과에 중요한 것을 알 수있다. 더 NK와 골수 세포가 우리가 단리 교종 함침 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)의 분석을위한 광범위한 프로토콜을 개발했다 GAL-1 결핍 종양 거부를 부여하기 위해 협력하는 메커니즘을 이해하기. 이 방법의 종양 미세 환경 내로 침투 PBMC를 비교하여 여기에서 설명된다 shRNA를 녹다운 통해 GAL-1 결핍 렌더링하는 것과 GL26 교종을 GAL-1 발현. 프로토콜에 대한 설명으로 시작하는 방법 문화와 GL26 가전을 준비동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접종에 대한 재편. 그러므로 초기 뇌 종양 미세 환경에서 신경 교종 함침 된 PBMC의 분리 및 유세포 분석에 관련된 단계를 설명한다. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 실험 디자인에 적용 할 수있다. 교종 함침 된 PBMC는 독립적 인 실험 내내 시점 유사한 종양에서 관찰 유사한 세포 수와 24 시간 후 종양 생착 자마자 두개 내 종양으로부터 분리 될 수있어서, 민감하고 재현성이다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출에서 방법을 수행 할 수있다. 대안 교종 모델 및 / 또는 셀 특정 검출 항체는 또한 몇몇 다른 immun의 침윤을 평가 experimentalists &#39;판단에 사용될 수있다전체적인 절차 변경 없이도 관심 E 세포 유형.

다음 게이팅 전략은 일반적인 실험에 사용되는 : FSC-SSC-대 → SSC-H 대 SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 대 대 카운트 → GR-1 대 CD11b를 → 카운트 대 NK1.1. 게이트는 GzmB 표현 (도 5a)에 기초하여 층화 GR-1 + / + CD11b를 골수 NK1.1 + 세포 및 NK 세포에 배치. NK1.1 + NK 세포 및 GR-1 + / CD11b를 SSC-A는 NK 세포의 작은 림프 크기 및 골수 세포의 비교적 큰 크기를 확인 대 FSC...

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

마우스 복막 구멍 세포의 분리

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

연구

면역학 및 감염병학

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

미토콘드리아 생물 에너지 분석을 위한 PBMC 수집 및 냉동 보관

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

저자 스포트라이트: Preservation of Bioenergetic Parameters in Peripheral Blood Mononuclear Cells After Cryopreservation (냉동 보존 후 말초 혈액 단핵 세포의 생체 에너지 매개변수 보존) 

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...