Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere il personale Biospherix per il loro aiuto per imparare a utilizzare il sistema di coltura cellulare Xvivo chiusa, soprattutto Matt Freeman; il personale di Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. per il loro lavoro nella creazione delle infrastrutture di laboratorio, in particolare Russ Hughes; il personale dell&#39;ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Strutture e servizi di supporto per il loro lavoro nel coordinare la ristrutturazione di laboratorio, in particolare Adam Lukhard e Devin Hugie; il personale dell&#39;ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Sistemi Informativi per il loro aiuto nella creazione delle infrastrutture di gestione dei dati e l&#39;accesso remoto, in particolare Viet Tran; Ospedale dei Bambini di Orange County Executive Management team per il loro lunga sostegno del progetto, in particolare il Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Questo lavoro è stato finanziato dal Children Hospital di Orange County e il California Institute for Regenerative Medicine attraverso la concessione TR3-05476 a PHS. Tutti gli autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Le cellule coltivate nei CPF vedono alcun cambiamento nelle concentrazioni di ossigeno o di anidride carbonica mentre si spostano da incubatrice al trattamento da camera al microscopio da camera e indietro. È fondamentale che le condizioni in ciascuna camera sono abbinati al particolare incubatore in cui le cellule sono mantenute prima che le cellule vengono rimosse dal termostato. L&#39;atmosfera all&#39;interno dell&#39;apparato è continuamente HEPA filtrata ed è personalizzabile in materia di concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica. Le cellule possono essere coltivate in concentrazioni standard per PSC o NSC, 5% e il 9%, rispettivamente; o concentrazioni alternative possono essere scelti per diversi tipi di cellule o per esperimenti specifici. Pertanto, l&#39;apparato è fornito con fonti costanti di grado medico ossigeno, anidride carbonica e azoto (Figura 4). Tutti e tre di questi gas sono forniti da sistemi molteplici specifiche di gas che garantiscono forniture costanti. L&#39;apparecchio è fornito con una miscela di gas di taratura rappresentati10% (± 0,01%) di anidride carbonica in ossigeno. I sistemi di collettore si trovano al di fuori dello stabilimento di produzione delle cellule e i gas vengono convogliati nella struttura attraverso il soffitto. Il gas di taratura è alloggiato all&#39;interno della struttura. L&#39;apparecchio è inoltre fornito con il vuoto casa, anche attraverso il soffitto. L&#39;utilizzo di un sistema di monitoraggio elettronico e wireless unità invio, le pressioni di uscita di tutti i collettori sono costantemente monitorati. Nel caso in cui qualsiasi pressione scende fuori campo, i gestori di impianti di produzione di celle vengono automaticamente telefonato e notificate in modo tale che l&#39;azione appropriata può essere adottata. I requisiti di alimentazione degli apparecchi sono soddisfatte da sei dedicati 120 V circuiti che scendono dal soffitto e collegate a generatori di back-up dell&#39;ospedale al fine di garantire un costante rifornimento. Il funzionamento dell&#39;apparecchiatura è controllata via software su un computer basato su PC alimentato tramite un gruppo di continuità. Queste disposizioni di potenza e computergarantire che il sistema funzioni continuamente anche in caso di guasto del sistema di alimentazione pubblica. Il software che controlla l&#39;apparecchio ha un&#39;interfaccia grafica user-friendly (figura 1) che consente il controllo delle concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica e pressioni di temperatura, umidità, e da camera. I valori di tutti questi parametri vengono registrate in continuo per fornire una registrazione parziale di tutti i parametri dell&#39;apparato. Questi dati viene eseguito il backup su un server remoto ogni notte per proteggere la loro integrità. Il computer e il software è possibile accedere in remoto dagli utenti amministrativi per valutare e / o modificare qualsiasi parametro. Inoltre, il computer e il software è possibile accedere in remoto, consentendo la valutazione interattiva dei parametri di apparecchi e la risoluzione dei problemi con gli utenti locali. Un ulteriore unità di invio allarme è collegato all&#39;apparato tale che gli operatori degli impianti di produzione di celle vengono informati di qualsiasi condizione out-of-range dell&#39;apparecchiatura. L&#39;accesso a distanza capabilities permettono il login e la valutazione delle specificità della condizione out-of-range. L&#39;apparecchio è progettato come un sistema modulare sia in una macro e micro senso. I singoli moduli di coltura cellulare, quali incubatori e camere di lavorazione, possono essere personalizzati in vista delle loro dimensioni e requisiti nonché nella loro disposizione rispetto all&#39;altro. Inoltre, la maggior parte delle funzioni di controllo dei singoli moduli sono essi stessi modulare tale che singoli regolatori gas atmosferici, per esempio, può essere facilmente sostituito senza notevoli disagi al sistema. camere di elaborazione specializzati, ad esempio uno per visualizzazione microscopica e manipolazione di colture cellulari, possono essere facilmente adattati al sistema. Sia a contrasto di fase e microscopio a fluorescenza sono all&#39;interno del sistema (figura 6) in modo che le cellule possono essere vivo macchiati, e le colonie possono essere sezionati nelle stesse condizioni atmosferiche come all&#39;interno tegli incubatrici. Routing dei cavi attraverso occhielli sigillati nelle pareti laterali della camera di trattamento consente apparecchiature come alimentatori e computer per essere tenuti al di fuori dell&#39;apparato, di solito su un carrello (Figura 6). Le camere di elaborazione nella struttura di produzione di cellule hanno un modello diverso da quello del flusso d&#39;aria BSC convenzionali. In BSC convenzionali, il flusso d&#39;aria scorre verso il basso da una bocca di scarico centrale e si divide in due flussi separati, che vengono poi ripresi da due differenti prese d&#39;aria nella parte anteriore ed a poppa del pavimento del cabinet. Per contro, il CPF ha un unico sfogo nella porzione anteriore del soffitto. L&#39;aria fluisce verso il basso e verso la parte posteriore della camera, dove viene quindi trascinato verso l&#39;alto in una bocchetta di aspirazione. Sebbene il CPF è intrinsecamente molto pulito, questo campo di flusso unico significa che i tecnici devono modificare leggermente la tecnica per ridurre il rischio di contaminazione. Come con un BSC convenzionale, un tecnico di laboratorio should evitare di mettere le mani monte di piastre di coltura di cellule aperte e bottiglie di media. Tuttavia, la direzione che è a monte è stato alterato nel CPF L&#39;impianto di laboratorio di produzione cellula stessa è abbastanza standard ed è dotato di un congelatore C -20 °, a -80 ° C congelatore, un frigorifero C 4 °, una centrifuga, e un bagno di acqua. Il laboratorio ha anche un lavandino con i comandi a pedale per il funzionamento conveniente a mani libere. Affinché questo laboratorio per diventare un impianto di produzione di celle funzionale clinica, tuttavia, devono ancora essere effettuate diverse modifiche aggiuntive. In primo luogo, l&#39;apparato stesso deve essere aggiornato per avere la capacità di monitorare i composti organici volatili, particolato, e le concentrazioni di biossido di cloro che viene utilizzato per la decontaminazione. In secondo luogo, una camera di trattamento contenente una macchina FACS può essere alloggiato e collegato al resto del dispositivo tramite un modulo buffer. Ciò consentirà di selezione cellulare e purificazione di trpopolazioni di cellule ansplantable alle condizioni ambientali adeguate. Infine, l&#39;intero apparato deve essere alloggiata all&#39;interno di una stanza pulita muro morbido. Ciò fornisce un International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente per l&#39;apparato 5. L&#39;elevata sterilità e la natura controllato dal computer del CPF lo rende un sistema ideale per le applicazioni future con la terapia a base di cellule e buoni processi di fabbricazione. Il rischio di contaminazione è notevolmente mitigato, ma ancora più importante, le condizioni di espansione delle cellule vengono automaticamente registrati e archiviati dal sistema informatico. Deviazioni in concentrazioni di gas, temperatura, umidità, e tutti gli eventi di accesso al sistema sono rigorosamente documentati. Questo può essere di grande aiuto quando si studiano i problemi di qualità del prodotto. Tuttavia, vi sono ancora limiti. L&#39;utilizzo di qualsiasi e tutti i reagenti e materiali di consumo (ad esempio, i componenti multimediali, pipette, piastre) deve essere documentata separatamente. Aggiungereitionally, ci sono una moltitudine di potenziali problemi (tra cui molte forme di errore umano) che possono sorgere che sono completamente estranei alle variabili documentate dal sistema di monitoraggio del CPF. Pertanto, la necessità di personale altamente qualificato e documentazione dettagliato manuale di compiti rimane al suo posto.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo System</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo Software</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>version i.o.2.1.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>M2H-C3-D-U-CO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Manifold</td>
			<td>Western Innovator</td>
			<td>CTM75-7-2-2-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A100006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Sodium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Protide</td>
			<td>PP1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s-based Cell dissociation Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13150-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIT-9500 Serum Supplement</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Serological pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanimaster 4</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>65332960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>A714239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Questo manoscritto descrive in dettaglio un impianto di produzione di cellule, e gli aspetti peculiari della coltura di cellule in un sistema chiuso. La maggior parte della struttura di produzione di celle e dispone di un apparecchio che ha un ingombro ridotto e può essere facilmente alloggiata all&#39;interno di un 6 x 7,5 m 2 Camera (Figura 2) su misura, chiuso, coltura cellulare. In nessun momento sono le cellule all&#39;interno dell&#39;apparato esposta al personale di laboratorio o ambiente. L&#39;apparecchiatura consiste di diversi moduli: una camera di processo, una cappa a flusso laminare, 2 camere buffer tenuta stagna tra il cappuccio e la camera di processo, due incubatori per colture cellulari, e una camera di microscopio adiacente alla camera di processo (Figura 3). Il sistema è controllato da un software consentendo variabili ambientali di essere controllati e monitorati (Figura 1). Il computer che esegue questo software è in un gruppo di continuità. I gas sono alimentati in the sistema da una serie di collettori per ossigeno, azoto e anidride carbonica (Figura 4). Gas per il dispositivo siano alimentati da sistemi molteplici che hanno due serie di vasche di ciascuno - un set attiva e una serie di riserva. Quando il set attivo viene prelevato, il collettore passa automaticamente ai serbatoi di sostituzione ordine di riserva impostato e del personale. L&#39;alimentazione è presente un sistema generatore di backup. Pluripotenti e cellule staminali neurali possono essere coltivate in condizioni di ipossia in questa struttura utilizzando i protocolli sviluppati in precedenza 9, con le complicazioni aggiunti inerenti alle apparecchiature romanzo. Le cellule staminali pluripotenti possono essere derivate utilizzando virus di Sendai, utilizzando anticorpi specifici pluripotenza per identificare colonie completamente transfettate, che vengono poi isolate ed espanse. (Figura 5A e B), Da queste iPSCs, cellule staminali neurali e neuroni possono essere derivate usando l&#39;inibizione doppia SMAD, e il loro fenotipo USI verificati<html> ng anticorpi NSC-specifici (Figura 5C e D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figura 1. Interfaccia grafica per la produzione di celle strumento. (A) La rappresentazione grafica del CPF è la schermata di default e corrisponde al disegno CAD mostrato in Figura 3. Un clic del mouse sul buffer Modulo 1 (2F nella figura 1) apre il suo schermo di controllo (B), dove sono impostati O 2 valori per abbinare la camera di trattamento (3 nella Figura 3). Allo stesso modo, cliccando sul processo di Camera o Incubator 1 porta le loro rispettive schermate di controllo (C e D, rispettivamente), dove i valori possono essere modificati o controllati a seconda dei casi.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figura 2. The Cell Production Facility. (A) Il sistema come visto da una vista anteriore destra. Notare i collegamenti di alimentazione e di gas nel soffitto e il carrello con gli accessori microscopio e il computer a destra. (B) La cappa a flusso laminare con le porte di accesso ai moduli buffer visti a destra. (C) La camera di processo con i due incubatori (porte nere) visto nella parte posteriore. (D) Una vista attraverso il lato destro del sistema che mostra il microscopio e monitorare con le porte delle camere di tampone visto in lontananza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figura 3. Un disegno CAD della cella Production. Tutti gli elementi che entrano nel dispositivo vengono dapprima pulito con alcool ed aria secca nella cappa a flusso laminare (1). Gli articoli vengono quindi trasferiti nella atmosfera appropriata nel modulo front buffer (2F) prima di passare nel modulo UCPC, o Process sezione (3). Le cellule sono coltivate in due incubatrici (4, 5). Colorazione delle cellule vive, colonia raccolta, valutazione della morfologia cellulare generale e analisi di migrazione avviene nel modulo UPC, o Microscopio Camera (6). Infine, i rifiuti esce dal sistema attraverso il modulo di buffer posteriore (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figura 4. Fonti di gas e di potere. (A) Il collettore di CO 2 è una configurazione 4 x 4 in quanto fornisce tutti gli incubatori del laboratorio. (B) Il collettore O 2 è un 2 x 2 di installazione e fornisce solo l&#39;impianto di produzione di cellule. Azoto per il sistema è generata in un vaporizzatore (C, appena sotto il segno Exit) collegato ad un collettore azoto liquido (verso destra) che riempie anche automaticamente cryofreezers (in basso a sinistra). Il collettore è una configurazione 2 x 2 è rifornita da due coppie di 160 L serbatoi di azoto liquido. CO 2, O 2 e N 2 sono forniti dal soffitto tramite Shutoffs (D). Casa vuoto viene fornito anche in questa posizione. Visto appena dietro le Shutoffs gas di alimentazione sono una coppia di cavi elettrici che alimentano il sistema.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figura 5. cellule staminali pluripotenti derivate in ipossia con il virus di Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura si trovano in Stover et al. 9), contrasto di fase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-macchiato con AF-594-marcato Tra-1-60, diluizione 1: 100 in media. Tutti iPSCs sono state trasdotte nella struttura di produzione di celle a 5% O 2 con il virus di Sendai. (C) contrasto di fase di NSCs SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivati, cresciuto al 5% O 2 in camera di diapositive. Le cellule sono state poi fissate in paraformaldeide al 4% e colorati con anticorpo primario Nestin anti-umano, e Alex-488 anticorpo secondario. Tutte le barre di scala sono a 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...