Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke de ansatte på Biospherix for deres hjelp i å lære å bruke Xvivo vedlagte cellekultur system, spesielt Matt Freeman; de ansatte i Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. for sitt arbeid i å sette opp laboratorieinfrastruktur, spesielt Russ Hughes; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling Fasiliteter og støttetjenester for sitt arbeid med å samordne laboratoriet oppussing, spesielt Adam Lukhard og Devin Hugie; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling av informasjonssystemer for deres hjelp i å sette opp dataadministrasjon infrastruktur og fjerntilgang, spesielt Viet Tran; Barnas Hospital of Orange County ledergruppen for sin mangeårige støtte til prosjektet, spesielt Dr. Maria Minon og Brent Dethlefs. Dette arbeidet ble finansiert av Barnas Hospital of Orange County og California Institute for Regenerative Medicine gjennom tilskudd TR3-05476 til PHS. Alle forfattere bidratt likt til dette arbeidet.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Celler dyrket innenfor CPF se noen endringer i oksygen eller karbondioksid konsentrasjoner som de beveger seg fra inkubatoren til behandling kammer mikroskop kammer og tilbake. Det er viktig at forholdene i hvert kammer er tilpasset til den spesielle kuvøse hvor cellene holdes før cellene blir fjernet fra inkubatoren. Atmosfæren i anordningen er kontinuerlig HEPA-filtrert og kan tilpasses med hensyn til oksygen og karbondioksid konsentrasjoner. Cellene kan dyrkes ved standard konsentrasjoner på pscs eller NSCs, 5% og 9%, henholdsvis; eller alternative konsentrasjoner kan velges for forskjellige celletyper eller spesifikke eksperimenter. Dermed er anordningen forsynt med konstante kilder til medisinsk kvalitet oksygen, karbondioksid og nitrogen (figur 4). Alle tre av disse gassene er levert av gass-spesifikke manifoldsystemer som sikrer konstant forsyninger. Apparatet er også forsynt med et kalibreringsgassblanding bestående av10% (± 0,01%) karbondioksyd i oksygen. De manifold-systemer er plassert utenfor cellen produksjonsanlegg og gassene føres inn i anlegget gjennom taket. Kalibrerings gass ligger innenfor innretningen. Apparatet er i tillegg forsynt med husvakuum, også gjennom taket. Ved hjelp av et elektronisk overvåkingssystem og trådløse senderenhetene, er utgangs presset fra alle manifolder konstant overvåket. I tilfelle at noen trykket faller utenfor rekkevidde, blir cellen produksjonsanlegg operatører automatisk ringte og varslet slik at nødvendige tiltak kan iverksettes. Strømkravene til apparatet blir møtt av seks dedikerte 120 V kretser synkende fra taket og koblet til sykehusets back-up generatorer for å sikre en konstant tilførsel. Drift av apparatet styres via programvare på en PC-basert datamaskin drevet gjennom en avbruddsfri strømforsyning. Disse kraft og PC ordningersikre at systemet fungerer kontinuerlig selv i tilfelle av en offentlig makt systemsvikt. Programvaren styring av anordningen har et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (figur 1), som gir mulighet for kontroll av oksygen og karbondioksid konsentrasjoner, så vel som temperatur, fuktighet, og kammertrykk. Verdiene for alle disse parametrene blir kontinuerlig registrert for å tilveiebringe en løpende registrering av alle apparater parametere. Denne informasjonen er støttet opp på en ekstern server hver natt for å beskytte sin integritet. Datamaskinen og programvaren kan nås eksternt av administrative brukere til å vurdere og / eller endre noen parameter. I tillegg kan maskinen og programvaren hentes eksternt, slik interaktiv vurdering av apparater parametere og feilsøking med lokale brukere. En ytterligere alarmsendeenhet er koplet til anordningen, slik at celleproduksjonsanlegg operatører blir varslet om en hvilken som helst ute-av-rekkevidde tilstand av anordningen. Fjerntilgangs capabilities tillate logg inn og vurdering av detaljene i out-of-range tilstand. Apparatet er utformet som et modulsystem både i makro- og mikro forstand. Individuelle cellekultur moduler, for eksempel kuvøser og behandlingskamre, kan tilpasses i forhold til sine dimensjoner og krav, samt i sin layout i forhold til hverandre. I tillegg er de fleste av de styrefunksjoner til de individuelle modulene er selv modulær slik at de enkelte atmosfæriske gassstyringer, for eksempel, kan lett skiftes ut uten vesentlig avbrudd i systemet. Spesialisert behandling kamre, slik som en for mikroskopisk visualisering og manipulering av cellekulturer, kan lett tilpasses til systemet. Både fase-kontrast og fluorescens mikroskop er inne i systemet (figur 6), slik at cellene kan bli direkte farget, og kolonier kan dissekert under de samme atmosfæriske betingelser som inne than inkubatorer. Ruting av kabler gjennom forseglede maljene i sideveggene i behandlingskammeret gjør det mulig for utstyr som strømforsyning og datamaskiner å bli holdt utenfor anordningen, vanligvis på en vogn (figur 6). Foredlings kamrene i cellen produksjonsanlegg har et annet mønster enn konvensjonelle luftstrøm BSC. I konvensjonelle BSC, strømmer luftstrømmen ned fra en sentral utløpskanal og splittes i to separate strømmer, som deretter tas opp av to forskjellige inntaksåpningene i den fremre og aktre del av kabinettets gulvet. I motsetning til dette har den CPF en enkelt ventil i den forreste del av taket. Luft strømmer nedover og mot baksiden av kammeret, hvor det blir så trukket oppover inn i en luftinntaksåpningen. Selv om CPF er i seg selv meget ren, betyr dette unike luftstrøm mønster som teknikere må justere litt sin teknikk for å redusere risikoen for forurensning. Som ved en konvensjonell BSC, en lab arbeideren should Unngå å plassere hendene oppstrøms åpne cellekulturplater og medie flasker. Imidlertid har den retning som er oppstrøms blitt endret på den CPF Cellen produksjonsanlegg laboratorium i seg selv er ganske standard og er utstyrt med en -20 ° C fryser, en -80 ° C fryser, en 4 ° C kjøleskap, en sentrifuge, og et vannbad. Laboratoriet har også en vask med fotkontroller for praktisk håndfri betjening. For at dette laboratorium for å bli en funksjonell klinisk celle produksjonsanlegg imidlertid flere ytterligere modifikasjoner må likevel bli gjort. For det første må innretningen i seg selv bli oppgradert for å ha kapasitet til å overvåke flyktige organiske forbindelser, partikler, og konsentrasjoner av klordioksyd som brukes til rensing. For det andre, kan et behandlingskammer som inneholder en FACS maskin være plassert og koblet til resten av apparaturen via en buffermodul. Dette vil muliggjøre cellesortering og rensing av transplantable celle populasjoner under riktige miljøforhold. Til slutt, må hele anordningen rommes i en myk vegg rent rom. Dette gir en International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 miljø for apparatet fem. Den høye sterilitet og datastyrt natur CPF gjør det til et ideelt system for fremtidige applikasjoner med cellebasert terapi og gode produksjonsprosesser. Risikoen for forurensning er sterkt dempet, men enda viktigere, er betingelsene for celle ekspansjon automatisk registrert og arkivert av datasystemet. Avvik i gasskonsentrasjoner, temperatur, fuktighet og alle arrangementer for tilgang til systemet er grundig dokumentert. Dette kan i stor grad hjelpe når undersøke produktkvalitet problemer. Det er imidlertid fremdeles begrensninger. Bruken av enhver og alle reagenser og forbruksmateriell (for eksempel mediekomponenter, pipetter, plater) må dokumenteres separat. Legg tilitionally, er det et mangfold av potensielle problemer (inkludert mange former for menneskelige feil) som kan oppstå som er fullstendig irrelevant for variablene dokumentert av CPF monitorsystem. Dermed blir behovet for høyt utdannet personell og detaljert manuell dokumentasjon av oppgaver er fortsatt på plass.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo System</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo Software</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>version i.o.2.1.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>M2H-C3-D-U-CO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Manifold</td>
			<td>Western Innovator</td>
			<td>CTM75-7-2-2-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A100006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Sodium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Protide</td>
			<td>PP1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s-based Cell dissociation Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13150-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIT-9500 Serum Supplement</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Serological pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanimaster 4</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>65332960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>A714239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Dette manuskriptet beskriver i detalj en celle produksjonsanlegg, og de unike aspektene ved dyrkning celler inne i et lukket system. Hovedtyngden av cellen produksjonsanlegg består av en skreddersydd, lukkede, cellekultur apparat som har en liten plass og kan enkelt plassert innenfor en 6 x 7,5 m 2 rom (figur 2). Ikke på noe tidspunkt er cellene i anordningen utsettes for laboratoriepersonalet eller miljø. Apparatet består av flere moduler: en prosesskammeret, en laminær strømningshette, 2 bufring luftslusen kamre mellom hetten og i prosesskammeret, to cellekultur inkubatorer, og et mikroskop kammer i tilknytning til prosesskammeret (figur 3). Systemet styres av programvare som tillater miljømessige variabler som skal styres og overvåkes (figur 1). Datamaskinen kjører denne programvaren er på en avbruddsfri strømforsyning. Gasser er matet inn the system ved et sett av manifolder for oksygen, nitrogen og karbondioksid (figur 4). Gasser for enheten er levert av manifold-systemer som har to sett med tanker hver - en aktiv sett og en reserve sett. Når det aktive settet blir trukket ned, slår manifold automatisk til reserve stille og ansatte bestille nye tanker. Strømmen er på en backup generator system. Pluripotent og neurale stamceller kan dyrkes i hypoksiske betingelser i dette anlegget ved hjelp av tidligere utviklet protokoller 9, med den ekstra komplikasjoner som ligger til det nye utstyr. Pluripotente stamceller kan utledes ved hjelp av Sendai-virus, ved hjelp av pluripotency-spesifikke antistoffer for å identifisere fullt transfekterte kolonier, som deretter isolert og ekspandert. (Figur 5A og B), Fra disse iPSCs, neurale stamceller og nevroner kan utledes ved hjelp av to SMAD hemming, og deres fenotype verifisert usi<html> ng NSC-spesifikke antistoffer (figur 5C og D). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk grensesnitt for Cell produksjonsanlegg. (A) Den grafiske fremstillingen av CPF er standardskjermen og samsvarer med CAD tegning vist i Figur 3. Et klikk på musen over Buffer Modul 1 (2F i figur 1) åpner sin kontrollskjerm (B) hvor O 2 verdier er satt til å samsvare med behandlingskammeret (3 i figur 3). Tilsvarende klikke på Process Chamber eller Inkubator en bringer opp sine respektive kontroll skjermer (C og D, henholdsvis), der verdiene kan endres eller overvåkes etter behov.<html> rFå = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figur 2. Cell produksjonsanlegg. (A) Systemet sett fra en front rett syn. Legg merke til kraft- og gasstilkoblinger i taket og vogna med mikroskopet tilbehør og datamaskin til høyre. (B) Den laminær hette med tilgangs dørene til buffer modulene sett til høyre. (C) Fremgangsmåten kammer med de to inkubatorer (svarte dører) sett på baksiden. (D) En visning gjennom høyre side av systemet viser mikroskop og skjerm med dørene til bufferkamre sett i det fjerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figur 3. En CAD ​​tegning av Cell produksjonsanlegg. Alle elementer som kommer inn i enheten først tørkes ned med alkohol og lufttørket i laminær hette (1). Elementer blir deretter overført til det passende atmosfære i frontbuffermodulen (2F) før de føres inn i UCPC modul, eller prosesskammeret (3). Celler dyrkes i de to inkubatorer (4, 5). Levende cellefarging, koloni plukking, vurdering av generell cellulær morfologi og migrasjonsanalyse finner sted i UPC modul, eller mikroskop kammer (6). Til slutt, avslutter avfall systemet gjennom den bakre buffer modul (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figur 4. Kilder til gasser og makt. (A) CO 2 manifold er en 4 x 4 oppsett som den leverer alle inkubatorer i laboratoriet. (B) O 2 manifold er en 2 x 2 oppsett og forsyninger bare cellen produksjonsanlegg. Nitrogen for systemet er generert i en fordamper (C, like nedenfor Markeingslys) festet til en flytende nitrogen manifold (til høyre) som også fyller automatisk cryofreezers (nederst til venstre). Manifolden er en 2 x 2-oppsett drives av to par 160 L flytende nitrogen stridsvogner. CO 2, O 2, og N-2 leveres fra taket gjennom shutoffs (D). Hus vakuum er også levert på dette stedet. Sett like bak levere gass shutoffs er et par strømkabler som leverer strøm til systemet.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figur 5. Pluripotent stamceller Avledet i Hypoksi med Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenklatur som finnes i Stover et al. 9), fasekontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs levende farget med AF-594-merket Tra-1-60, 1: 100 fortynning i media. Alle iPSCs ble omformet i cellen produksjonsanlegg i 5% O 2 med Sendai-virus. (C) Fase kontrasten SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC-avledet NSCs, vokst med 5% O 2 i kammer lysbilder. Celler ble deretter fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med anti-humant nestin primært antistoff, og Alex-488 sekundært antistoff. Alle skala barer er på 1001; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollert kortikale Impact modell av mus hjerneskade med terapeutisk transplantasjon av Human indusert pluripotent Stem Cell-avledet nevrale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogenic endotelet differensiering fra Human Pluripotent stamceller i en mater-og Xeno-fri definert tilstand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...