Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a equipe Biospherix por sua ajuda em aprender a usar o sistema de cultura celular Xvivo fechado, especialmente Matt Freeman; o pessoal do Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. para o seu trabalho na criação da infra-estrutura laboratorial, especialmente Russ Hughes; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Instalações e Serviços de Suporte para o seu trabalho na coordenação da remodelação de laboratório, especialmente Adam Lukhard e Devin Hugie; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Sistemas de Informação pela sua ajuda na criação da infra-estrutura de gerenciamento de dados e acesso remoto, especialmente Viet Tran; Hospital Infantil de Orange County Equipe de Gestão Executiva por seu apoio de longa data do projeto, especialmente Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Este trabalho foi financiado pelo Hospital Infantil de Orange County e do California Institute for Regenerative Medicine através TR3-05476 subvenção para PHS. Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

As células cultivadas dentro das CPF não vejo mudanças nas concentrações de oxigênio ou dióxido de carbono que se deslocam de incubadora para o processamento de câmara para microscópio de câmara e volta. É crítico que as condições em cada uma das câmaras são combinadas para a incubadora particular em que as células são mantidas antes que as células são removidas da incubadora. A atmosfera dentro do aparelho é continuamente HEPA-filtrado e é personalizável no que diz respeito às concentrações de oxigênio e dióxido de carbono. As células podem ser cultivadas em concentrações normais para unidades ou NSC, 5% e 9%, respectivamente; ou concentrações alternativos podem ser escolhidos para diferentes tipos de células ou para experiências específicas. Assim, o aparelho é fornecido com fontes de oxigénio constante de grau médico, dióxido de carbono e azoto (Figura 4). Todos os três destes gases são fornecidos por sistemas de colector de gás específico do que assegurar o abastecimento constante. O aparelho é também fornecido com uma mistura de gás de calibração consiste em10% (± 0,01%) de dióxido de carbono em oxigénio. Os sistemas de manifold estão alojados fora da unidade de produção de células e os gases são canalizados para a instalação através do teto. O gás de calibração está alojado no interior da instalação. O aparelho é fornecido adicionalmente com aspirador de casa, também através do teto. Usando um sistema de monitoramento eletrônico e sem fio unidades envio, as pressões de todos os colectores de saída são constantemente monitorados. No caso em que qualquer pressão cai fora do intervalo, os operadores das instalações de produção de células são automaticamente telefonou e notificada de tal forma que medidas apropriadas possam ser tomadas. Os requisitos de energia do aparelho são atendidas por seis dedicados 120 V circuitos que descem do teto e ligados a geradores de back-up do hospital para garantir um fornecimento constante. O funcionamento do aparelho é controlado via software em um computador baseado em PC alimentado através de uma fonte de alimentação ininterrupta. Estes arranjos de poder e de computadorassegurar que o sistema funciona continuamente, mesmo em caso de falha do sistema do poder público. O software que controla o aparelho tem uma interface gráfica amigável (Figura 1) que permite o controlo das concentrações de oxigênio e dióxido de carbono, bem como pressões de temperatura, umidade, e de câmara. Os valores de todos estes parâmetros são registadas continuamente para fornecer um registro de execução de todos os parâmetros do aparelho. Este dados são copiados para um servidor remoto a cada noite para proteger a sua integridade. O computador eo software pode ser acessado remotamente por usuários administrativos para avaliar e / ou alterar qualquer parâmetro. Além disso, o computador eo software pode ser acessado remotamente, permitindo avaliação interativa de parâmetros de aparelhos e solução de problemas com os usuários locais. Uma unidade de envio de alarme adicional é ligado ao aparelho de tal modo que os operadores das instalações de produção de células são notificados de qualquer condição fora-de-gama do aparelho. O acesso remoto capabilities permitir o login e avaliação das especificidades da condição fora-de-gama. O aparelho é concebido como um sistema modular tanto em uma macro e micro um sentido. módulos de cultura de células individuais, tais como incubadoras e câmaras de processamento, podem ser personalizadas no que diz respeito às suas dimensões e os requisitos, bem como na sua disposição com respeito um ao outro. Além disso, a maior parte das funções de controlo dos módulos individuais são eles próprios modular de tal modo que os controladores de gás atmosféricos, por exemplo, pode ser facilmente substituído sem perturbação significativa para o sistema. câmaras de processamento especializado, tal como um para visualização microscópica e manipulação de culturas de células, podem ser facilmente adaptado ao sistema. Ambos de contraste de fase e microscópio de fluorescência estão dentro do sistema (Figura 6), de modo que as células podem ser coradas vivo, e as colónias podem ser dissecados nas mesmas condições atmosféricas dentro como tele incubadoras. Encaminhamento de cabos por meio de ilhós seladas nas paredes laterais da câmara de processamento permite que o equipamento, tal como fontes de alimentação e computadores para ser mantido no exterior do aparelho, geralmente sobre um carrinho (Figura 6). As câmaras de processamento na unidade de produção de células têm um padrão de fluxo de ar diferente do BSC convencionais. Em BSCs convencionais, o fluxo de ar flui para baixo a partir de um orifício de evacuação central e se divide em duas correntes separadas, que são então levados até por duas aberturas de entrada diferentes na parte da frente e para trás do piso do armário. Em contraste, a PCF tem uma única abertura na parte da frente do tecto. O ar flui para baixo e em direcção à parte de trás da câmara, onde é, em seguida, conduzido para cima, para uma entrada de ventilação. Embora o CPF é inerentemente muito limpos, este padrão de fluxo de ar única significa que os técnicos têm de ajustar ligeiramente a sua técnica para reduzir o risco de contaminação. Tal como acontece com um BSC convencional, um trabalhador s laboratórioevitar hould colocando suas mãos a montante de placas de cultura de células abertas e garrafas de mídia. No entanto, o sentido a montante é que tenha sido modificado no CPF O laboratório instalação de produção de células em si é bastante padrão e vem equipado com um C congelador -20 °, a -80 ° C freezer, a 4 ° C geladeira, uma centrífuga, e um banho de água. O laboratório também tem uma pia com pedais para operação conveniente mãos livres. Para que este laboratório para se tornar uma unidade de produção de células clínica funcional, no entanto, devem ainda ser feitas várias modificações adicionais. Em primeiro lugar, o aparelho em si tem de ser actualizado para ter a capacidade de monitorar compostos voláteis orgânicos, partículas, e das concentrações de dióxido de cloro que é utilizado para descontaminação. Em segundo lugar, uma câmara de processamento que contém uma máquina de FACS podem ser alojados e ligado ao resto do aparelho através de um módulo de memória intermédia. Isto irá permitir a separação de células e purificação de trpopulações de células ansplantable nas condições ambientais adequadas. Por fim, todo o aparelho deve ser instalado dentro de uma parede macia sala limpa. Isso fornece uma International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente para o aparelho 5. A alta esterilidade e natureza controlado por computador do CPF faz com que seja um sistema ideal para aplicações futuras com a terapia à base de células e os processos de fabrico boas. O risco de contaminação é bastante atenuados, mas o mais importante, as condições de expansão celular são registados automaticamente e arquivados pelo sistema de computador. Desvios em concentrações de gases, temperatura, umidade e todos os eventos de acesso ao sistema são rigorosamente documentadas. Isso pode ajudar muito na investigação de problemas de qualidade do produto. No entanto, ainda há limitações. O uso de qualquer e todos os reagentes e materiais (por exemplo, componentes de mídia, pipetas, placas) deve ser documentada separadamente. Adicionaritionally, há uma infinidade de problemas potenciais (incluindo muitas formas de erro humano) que podem surgir que são completamente alheios às variáveis ​​documentados pelo sistema de monitoramento do CPF. Assim, a necessidade de pessoal altamente treinado e documentação manual detalhado de tarefas permanece no lugar.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo System</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo Software</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>version i.o.2.1.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>M2H-C3-D-U-CO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Manifold</td>
			<td>Western Innovator</td>
			<td>CTM75-7-2-2-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A100006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Sodium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Protide</td>
			<td>PP1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s-based Cell dissociation Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13150-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIT-9500 Serum Supplement</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Serological pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanimaster 4</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>65332960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>A714239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Este manuscrito descreve com algum detalhe uma instalação de produção de células, e os aspectos únicos da cultura de células dentro de um sistema fechado. A maior parte das instalações de produção de células compreende um aparelho de cultura celular feito por encomenda, fechado, que tem uma pegada pequena e pode ser facilmente instalado dentro de um 6 x 7,5 m 2 quarto (Figura 2). Em nenhum momento são as células dentro do aparelho exposto ao pessoal de laboratório ou ambiente. O aparelho é constituído por vários módulos: uma câmara de processo, uma câmara de fluxo laminar, 2 câmaras de tamponamento Airlock entre o capuz e a câmara de processo, duas incubadoras de cultura de células, e um microscópio de câmara adjacente à câmara de processo (Figura 3). O sistema é controlado por software que permite variáveis ​​ambientais a serem controladas e monitoradas (Figura 1). O computador que executa o software está em uma fonte de alimentação ininterrupta. Os gases são alimentados em the sistema por um conjunto de colectores de oxigénio, azoto e dióxido de carbono (Figura 4). Gases para o dispositivo são fornecidos por sistemas múltiplos que têm dois conjuntos de tanques cada - um conjunto ativo e um conjunto de reserva. Quando o conjunto ativo é desenhada para baixo, o colector muda automaticamente para os tanques de substituição ordem reserva constituídos e de pessoal. O poder está em um sistema gerador de backup. Pluripotentes e células estaminais neurais podem ser cultivadas em condições de hipóxia nesta instalação utilizando protocolos previamente desenvolvidos 9, com as complicações adicionais inerentes ao equipamento novo. As células estaminais pluripotentes podem ser derivados utilizando vírus Sendai, utilizando anticorpos específicos de pluripotência para identificar colónias totalmente transfectadas, as quais são então isoladas e expandidas. (Figura 5A e B), A partir destes iPSCs, células estaminais neuronais e neurónios podem ser derivados usando SMAD inibição dupla, e o seu fenótipo verificado USI<html> Os anticorpos específicos para NSC ng (Figura 5C e D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figura 1. Interface Gráfica para o Mecanismo de célula de produção. (A) A representação gráfica do CPF é a tela padrão e combina o desenho CAD mostrado na Figura 3. Um clique do mouse sobre o buffer Módulo 1 (2F na Figura 1) abre seu ecrã de controlo (B), onde os valores de o 2 são definidas para coincidir com a câmara de processamento (3 na Figura 3). Da mesma forma, clicando sobre o Processo da Câmara ou Incubadora 1 traz suas respectivas telas de controle (C e D, respectivamente), onde os valores podem ser alterados ou monitorados, conforme apropriado.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figura 2. O dispositivo de célula de produção. (A) O sistema como visto de uma vista frontal direita. Observe as conexões de alimentação e de gás no tecto e o carro com os acessórios de microscópio e computador para a direita. (B) A câmara de fluxo laminar com as portas de acesso aos módulos de tampão visto no lado direito. (C) A câmara de processo com as incubadoras duas portas (preto) visto na parte traseira. (D) Uma vista através do lado direito do sistema que mostra o microscópio e monitor com as portas para as câmaras de amortecimento visto à distância. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> t &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figura 3. Um desenho de CAD do mecanismo de célula de produção. Todos os artigos que entram no dispositivo são primeiramente limpo com álcool e seco ao ar na câmara de fluxo laminar (1). Os artigos são, em seguida, transferida para o ambiente apropriado no módulo de tampão dianteira (2F) antes de serem passados ​​para o módulo de UCPC, ou processo de câmara (3). As células são cultivadas nas duas incubadoras (4, 5). Coloração de células vivas, colônia colheita, a avaliação da morfologia celular geral e análise de migração ocorre no módulo UPC, ou Microscópio Câmara (6). Finalmente, resíduos sai do sistema através do módulo tampão traseiro (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figura 4. Fontes de Gases e poder. (A) O colector de CO 2 é uma configuração de 4 x 4, uma vez que fornece todos os incubadoras de laboratório. (B) O colector de O 2 é uma configuração única e suprimentos a instalação de produção de células de 2 x 2. Azoto para o sistema é gerado num vaporizador (C, apenas o sinal de saída abaixo) ligado a um colector de azoto líquido (à direita) que também enche automaticamente cryofreezers (inferior esquerdo). O colector é uma configuração 2 x 2 sendo fornecida por dois pares de tanques de 160 L de azoto líquido. CO 2, O 2, N 2 e são fornecidos através do teto shutoffs (D). câmara de vácuo é também fornecida neste local. Visto apenas atrás das shutoffs gás de alimentação são um par de cabos de energia que fornecem energia ao sistema.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figura 5. As células pluripotentes estaminais derivadas em hipóxia com o vírus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura encontrados em Stover et al. 9), contraste de fase 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-coradas com Tra-1-60 AF-594-rotulados, diluição 1: 100 na mídia. Todos os iPSCs foram transduzidas na instalação de produção de células em 5% de O 2 com o vírus de Sendai. (C) O contraste de fase de NSC-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivados, crescido em 5% de O 2 em lâminas de câmara. As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com o anticorpo primário anti-nestina humana, e o anticorpo secundário Alex-488. Todas as barras de escala são a 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...