Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить благодарность сотрудникам в Biospherix за их помощь в обучении использовать Xvivo закрытую систему культивирования клеток, особенно Matt Freeman; сотрудники Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. для их работы в создании лабораторной инфраструктуры, особенно Russ Hughes; сотрудники Детской больницы Orange County департамента средств и служб поддержки для обеспечения их работы в координации лабораторных реконструируют, особенно Адам Lukhard и Девин Hugie; сотрудники Детской больницы Orange County отдела информационных систем за их помощь в создании инфраструктуры управления данными и удаленный доступ, особенно Viet Tran; Детская больница группы Исполнительного управления Orange County за многолетнюю поддержку проекта, особенно д-ра Марии Minon и Brent Dethlefs. Эта работа была профинансирована Детской больницы Orange County и Калифорнийского института регенеративной Medicinе через грант TR3-05476 к PHS. Все авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Клетки, выращенные в РПС не видят каких-либо изменений в атмосфере кислорода или углекислого газа концентрации, как они перемещаются из инкубатора в камеру обработки с микроскопом камеру и обратно. Очень важно, чтобы условия в каждой камере сопоставляются с конкретным инкубаторе, в котором клетки хранятся до того, как клетки удаляются из инкубатора. Атмосфера внутри аппарата непрерывно НЕРА-фильтром и настраивается в отношении концентрации кислорода и двуокиси углерода. Клетки могут быть выращены при стандартных концентрациях для ЧОК или NSCs, 5% и 9%, соответственно; или альтернативные концентрации могут быть выбраны для различных типов клеток или для конкретных экспериментов. Таким образом, устройство поставляется с постоянными источниками медицинской чистоты кислорода, углекислого газа и азота (рисунок 4). Все три из этих газов снабжены газом конкретных систем коллектора, которые обеспечивают постоянные поставки. Устройство также поставляется с калибровочным газовой смеси, состоящей из10% (± 0,01%) двуокиси углерода в кислороде. Многообразие систем расположены за пределами производственной ячейки объекта и газы по трубопроводу в средство через потолок. Калибровочного газа расположен в пределах объекта. Устройство дополнительно снабжен вакуумом, также через потолок. Используя электронную систему мониторинга и беспроводной отправки единиц, выходное давление всех коллекторов постоянно контролируются. В том случае, если какое-либо давление выпадает из диапазона, операторы установки по производству ячейки автоматически позвонил по телефону и уведомление таким образом, что соответствующие меры могут быть приняты. Требования к мощности аппарата выполнены шестью выделенными 120 V цепей, спускающимися с потолка и соединен с резервными генераторами больницы, чтобы обеспечить постоянное снабжение. Работа устройства управляется с помощью программного обеспечения на компьютере на базе ПК через источник бесперебойного питания. Эти силовые и компьютерные устройстваубедитесь, что система функционирует непрерывно, даже в случае выхода из строя системы публичной власти. Программное обеспечение управления устройством имеет удобный графический интерфейс (рисунок 1) , который позволяет для контроля концентрации кислорода и углекислого газа, а также давления температуры, влажности и камеры. Значения всех этих параметров непрерывно записываются, чтобы обеспечить бегущую запись всех параметров аппарата. Эти данные резервное копирование на удаленный сервер каждую ночь, чтобы защитить их целостность. Компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ административными пользователями для оценки и / или изменить любой параметр. Кроме того, компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ, что позволяет интерактивной оценки параметров аппаратуры и устранение неполадок с локальными пользователями. Дополнительный сигнал тревоги блок передачи соединен с устройством таким образом, чтобы операторы производства сотового объекта уведомляются о любом из-за допустимые пределы состояния аппарата. Удаленный доступ сapabilities позволяют войти и оценка особенностей состояния вне диапазона. Аппарат выполнен в виде модульной системы как в макро и микро смысле. Модули Отдельные культура клеток, такие как инкубаторы и обработки камер, могут быть настроены в отношении их размеров и требований, а также в их расположение по отношению друг к другу. Кроме того, большинство функций управления отдельными модулями являются сами модульное таким образом, что отдельные контроллеры атмосферный газ, например, может быть легко заменен без существенного сбоев в системе. Специализированные камеры обработки, например, один для микроскопического визуализации и манипуляций с культурами клеток, легко адаптируются к системе. Оба фазового контраста и флуоресцентный микроскоп находятся внутри системы (рисунок 6) таким образом , что клетки могут быть живой окрашенном, и колонии могут быть расчленены в тех же атмосферных условиях, в тон инкубаторы. Прокладка кабелей через герметичные прокладки в боковых стенках рабочей камеры позволяет такое оборудование, как источники питания и компьютеры , которые будут храниться вне устройства, как правило , на тележке (рисунок 6). Камеры для обработки в производственном объекте ячейки имеют различный характер воздушного потока по сравнению с обычными КБС. В обычных БББ, воздушный поток стекает вниз из центрального выпускного отверстия и разделяется на два отдельных потока, которые затем обрабатывают с помощью двух различных отверстий для забора в передней и задней части пола шкафа. В противоположность этому, СПЛ имеет один отверстие в передней части потолка. Воздух течет вниз и по направлению к задней части камеры, где он затем обращается вверх в отверстие для забора воздуха. Хотя СПЛ по своей сути очень чистый, этот уникальный образец потока воздуха означает, что технические специалисты должны слегка скорректировать свою технику, чтобы уменьшить риск заражения. Как и с обычным BSC, лаборатории работника сhould Избегайте размещения их руки перед открытыми планшеты для культивирования клеток и медиа-бутылок. Тем не менее, направление, которое находится выше по течению было изменено в ЦПС Объект производственной лаборатории клетка сама по себе является довольно стандартным и оснащен C морозильнике -20 °, -80 ° C морозильнике, 4 ° C холодильник, центрифуга и водяная баня. В лаборатории также имеется раковина с педалей управления для удобной работы без участия рук. Для того, чтобы этой лаборатории, чтобы стать функциональной клинической производственной ячейки объекта, однако, несколько дополнительных модификаций еще должны быть сделаны. Во-первых, сам аппарат должен быть повышен, чтобы иметь возможность отслеживать летучих органических соединений, частиц и концентрации диоксида хлора, который используется для обеззараживания. Во-вторых, рабочая камера, содержащая машину FACS может быть размещен и соединен с остальной частью аппарата через буфер модуля. Это позволит для сортировки и очистки тр клетокпопуляции ansplantable клеток при соответствующих условиях окружающей среды. И, наконец, весь аппарат должен быть размещен внутри мягкой стены чистой комнате. Это обеспечивает Международная организация по стандартизации (ISO) класс 8 среды для устройства 5. Высокой стерильности и компьютерным управлением характер СПЛ делает его идеальной системой для будущих приложений с клеточной терапии и хороших производственных процессов. Риск заражения значительно смягчены, но что более важно, условия расширения ячейки автоматически записываются и архивируются с помощью компьютерной системы. Отклонения в концентрации газа, температуры, влажности и всех событий доступа в систему строго документированы. Это может значительно помочь при исследовании проблемы качества продукции. Тем не менее, все еще существуют ограничения. Использование любых и всех реагентов и расходных материалов (например, компоненты среды, пипеток, тарелки) должны быть задокументированы отдельно. Добавитьitionally, существует множество потенциальных проблем (в том числе многих форм человеческой ошибки), которые могут возникнуть, которые абсолютно не связаны с переменными документированных системы мониторинга ПСЛ. Таким образом, потребность в хорошо подготовленных кадров и детальной ручной документации задач остается на месте.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo System</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo Software</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>version i.o.2.1.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>M2H-C3-D-U-CO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Manifold</td>
			<td>Western Innovator</td>
			<td>CTM75-7-2-2-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A100006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Sodium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Protide</td>
			<td>PP1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s-based Cell dissociation Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13150-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIT-9500 Serum Supplement</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Serological pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanimaster 4</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>65332960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>A714239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Эта рукопись описывает в некоторых деталях производственной ячейки объекта, а также уникальные аспекты культивирования клеток внутри замкнутой системы. Основная часть производственной ячейки объекта включает в себя заказные, закрываемый, культуры клеток аппарат , который имеет небольшие размеры и может быть легко смонтированные в 6 х 7,5 м 2 комнатной (рисунок 2). Ни в какое время являются клетки внутри аппарата воздействию лабораторного персонала и окружающей среды. Устройство состоит из нескольких модулей: технологическую камеру, ламинаре, 2 буферизация Airlock камер в между капотом и рабочей камеры, двух инкубаторах клеточных культур и микроскопа камеры , прилегающей к рабочей камере (рисунок 3). Система управляется с помощью программного обеспечения , позволяющего экологические переменные , которые будут управляться и контролироваться (Рисунок 1). Компьютер это программное обеспечение находится на источник бесперебойного питания. Газы подают в гоэлектронной системы с помощью набора коллекторы для кислорода, азота и углекислого газа (рисунок 4). Газы для устройства снабжены разнообразными системами, которые имеют два комплекта танков каждый - активный набор и набор резерва. Когда активный набор обращается вниз, коллектор автоматически переключается на резервные и установлены на персонал запасных заказ танков. Питания на резервную систему генератора. Плюрипотентных и нервные стволовые клетки можно выращивать в условиях гипоксии в этом объекте с использованием ранее разработанных протоколов 9, с дополнительными осложнениями , присущих новому оборудованию. Плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены с использованием вируса Сендай, используя плюрипотентности-специфических антител для идентификации полностью трансфектированных колоний, которые затем выделяют и развернутые. (Рисунок 5А и В), Из этих ИПСК, нервные стволовые клетки и нейроны могут быть получены с помощью ингибирования двойной Smad, и их фенотип проверены USI<html> нг NSC-специфических антител (рис 5С и D). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Рисунок 1. Графический интерфейс для объекта Cell Production. (А) Графическое представление СПЛ является экран по умолчанию и соответствует чертеж CAD , показанный на рисунке 3. Щелчок мыши над буфером модуль 1 (2F на рисунке 1) открывает экран управления (B) , где 2 значения O устанавливаются в соответствии с рабочей камере (3 на рисунке 3). Точно так же, нажав на технологической камере или Инкубатор 1 приносит свои соответствующие экраны управления (C и D, соответственно), где значения могут быть изменены или отслеживаемые в зависимости от обстоятельств.<html> rget = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Рисунок 2. Клетка производственном объекте. (А) Система , как видно из переднего правого ракурса. Обратите внимание на электрические и газовые соединения на потолке и тележку с микроскопом и аксессуаров компьютера справа. (B) Капот ламинарный поток с дверями доступа к буферу модулей видно справа. (C) Процесс камеры с двумя инкубаторы (черные двери) видно сзади. (D) Вид через правую сторону системы , показывающий микроскоп и монитор с дверями в буфер камеры видно на расстоянии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> т &quot;ВОК: Keep-together.within-страница =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Рисунок 3. Чертеж САПР Объекта сотового Production. Все детали , поступающие на устройство, сначала протирать спиртом и сушат на воздухе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха (1). Элементы затем переходит к соответствующей атмосферы в модуле передней буферной (2F) перед поступлением в модуль UCPC, или технологическую камеру (3). Клетки культивируют в двух инкубаторах (4, 5). Живая клетка окрашивания, собирание колонии, оценка общей клеточной морфологии и анализа миграции происходит в модуле UPC или микроскоп камера (6). И, наконец, отходы выходит из системы через модуль заднего буфера (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.</a> &lt;<html> / Р&gt; <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Рисунок 4. Источники газов и Силы. (A) CO 2 многообразие является установка 4 х 4 , как она поставляет все инкубаторы лаборатории. (B) O 2 многообразие представляет собой 2 х 2 установки и расходные материалы только производство ячейки объекта. Азот для системы генерируется в испарителе (C, как раз под знаком выход) , присоединенные к жидким азотом коллектора (справа) , который также автоматически заполняет cryofreezers (внизу слева). Многообразие является установка 2 х 2 подается двумя парами 160 л танков жидкого азота. CO 2, O 2, N 2 и поставляются с потолка через отсечные (D). вакуумный дом также поставляется в этом месте. Видел только за поставки газа отключений являются парой силовых кабелей, которые поставляют питание системы.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; целевых = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Рисунок 5. плюрипотентные стволовые клетки , полученные в Гипоксия с вирусом Сендай. (A) SC187-SF4-2I0-E3 иПСК иПСК (номенклатура найдены в Стовера и др. 9), фазовый контраст 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 иПСК живой окрашивали AF-594-меченым TRA-1-60, разведение 1: 100 в средствах массовой информации. Все иПСК были трансдуцированных в производственном объекте клеток в 5% O 2 с вирусом Сендай. (C) Фаза контраст SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC-производных NSCs, выращенных при 5% O 2 в камере слайдов. Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегида и окрашивали анти-человеческим Nestin первичным антителом, и Алекс-488 вторичное антитело. Все масштабные линейки находятся на 1001; м . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Контролируемая кортикальная модель воздействия мышечной травмы мозга с терапевтической трансплантацией индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронных клеток

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Гемогенная дифференциация эндотелия от стволовых клеток человека в Feeder- и Ксено-свободноопределенное состояние

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...