Name: administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research at JoVE.com

De financiering werd verstrekt door USDA CRIS 5347-22620-021-00D en, gedeeltelijk, door de Landbouw en Voedselvoorziening Research Initiative Competitive Grant niet. 2011-67009-30141 van de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Johanna Nassif. We danken ook Paul Baker, David Horton, Diego Nieto en Frances Sivakoff voor het verstrekken van een aantal van de foto&#39;s die in figuur 3.

1. Interne Mark Retention en Detection Procedure <ol><li> Interne markeringsprocedure <ol><li> Verzamel insecten van belang (n ≈ 100 personen) van een laboratorium kolonie gekweekt op een kunstmatig dieet of uit het veld en te verdelen in twee schone opfok containers. </li><li> Plaats een regelmatige 20 ml voeding packet (alleen negatieve controlebehandeling) in een van de containers. Aanvulling op een tweede 20 ml kunstmatige voeding pakket met 1,0 ml van een 1,0 mg / ml kip IgG / IgY oplossing, meng goed,...

De geleedpotigen eiwit immunomarking procedure werd voor het eerst beschreven bijna een kwart eeuw geleden 9. Sindsdien is de procedure aangepast aan de verspreiding patronen van een breed scala van geleedpotigen met behulp van zowel intern als extern beheerd IgG / IgYs bestuderen. Deze eiwitten zijn standvastig markers gebleken voor uiteenlopende insectensoorten tot nu toe getest. Zoals hierboven genoemd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van IgG / IgYs is dat ze erg duur. Bijgevolg IgG / IgYs zijn...

Het volgen van de beweging van atropodenplagen, natuurlijke vijanden (parasieten en predatoren) en bestuivers in de natuur is van essentieel belang voor een beter begrip hoe de ecosysteemdiensten te verbeteren. De belangrijkste component voor de meeste dispersie onderzoek is een betrouwbare methode om de geleedpotigen (s) van belang coderen. Een verscheidenheid van materialen (bijvoorbeeld verven, kleurstoffen, gekleurde stof, markeringen, zeldzame elementen, eiwitten) zijn gebruikt om geleedpotigen markeren hun populatiedynamiek, dispersie capaciteiten beoordelen voeden gedrag en andere ecologische interacties 1,2. De geschiktheid van een merker voor een bepaalde spreiding onderzoek afhankelijk van het type studie uitgevoerd zijn. Er zijn drie grote indelingen voor het markeren van geleedpotigen: (1) mark-afgifte herovering (MRR), (2) mark-capture, en (3) self-mark-capture. Voor mark-afgifte herovering onderzoek, de onderzoeker markeert meestal de geleedpotigen collectief in het laboratory en vrijgeeft op een centraal punt in het veld. De geleedpotigen worden vervolgens heroverd op verschillende ruimtelijke en temporele intervallen met behulp van verschillende inrichtingen (bijv sweep net, vacuüm, vangplaat) 3,4,5. De heroverd monsters worden vervolgens onderzocht op het specifieke merk te onderscheiden vrijgelaten uit inheemse individuen. Voor mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal het merk direct in het veld met behulp van spuitapparatuur (bv rugzak sproeier, giek en nozzle spuit). De beste markers voor mark-capture onderzoek zijn goedkoop en gemakkelijk aan te brengen op de habitat van de geleedpotigen&#39;s. Voor self-mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal merken een geleedpotigen aas 6,7 of nestingang 8. Op zijn beurt, de geleedpotigen markeert zelf intern door het verslinden van de gemarkeerde aas of extern door &quot;borstelen&quot; tegen de mark zodra ze uit het nest. Zoals hierboven vermeld, zijn vele soorten markers ons geweested van verschillende geleedpotigen taggen. Echter, weinig bruikbaar voor alle drie de verspreiding onderzoekscategorieën. De ontwikkeling van het eiwit immunomarking procedure een grote doorbraak voor het markeren van insecten. Immunomarking zet een eiwit label geleedpotigen intern of extern die op zijn beurt wordt gedetecteerd met een anti-eiwit-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). De eerste dergelijke proteïne markers gebruikt waren konijn immunoglobuline (IgG) en kip IgG / IgY 9,10. Ze bleek te zijn zeer effectief punten voor MRR en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking). Helaas, IgG / IgY eiwitten zijn duur en daarom niet praktisch voor mark-capture onderzoek en de meeste vormen van self-mark-capture onderzoek. Vervolgens werden de tweede generatie eiwitdetectie ELISA&#39;s ontwikkeld voor de eiwitten die in kip eiwit (albumine), koemelk (caseïne) en sojamelk (trypsineremmer eiwit). Elke test is zeer gevoelig, specifiek en,Belangrijker gebruikt eiwitten die veel goedkoper zijn dan de IgG / IgY eiwitten 11 zijn. Deze eiwitten zijn effectief voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking) bewezen. In dit artikel beschrijven we en demonstreren hoe eiwitten merk retentie laboratorium studies uit te voeren. Dergelijke onderzoeken zijn de eerste fase van het onderzoek voor elk type veld dispersie studie. Specifiek, is het essentieel dat de onderzoekers weten hoe lang de markering op de beoogde geleedpotigen worden gehandhaafd dan het opstarten van veld dispersie studies. Hier beschrijven we en laten zien hoe je intern en extern te markeren insecten voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture veld type studies. Vervolgens hebben we laten zien hoe de aanwezigheid van de merken op te sporen met indirecte en sandwich ELISA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Food storage container (for insect rearing)</td>
			<td>Rubbermaid/Tupperware</td>
			<td>Various sizes</td>
			<td>Various manufacturers &#38; vendors. Mesh fabric is glued in a window `</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td>
			<td>Teleflex-Hudson RCI</td>
			<td>1881</td>
			<td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td>
			<td>Continental Lab Products</td>
			<td>4445.X</td>
			<td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td>
			<td>RPI Corp.</td>
			<td>145746</td>
			<td>This design is nice because it doesn&#39;t crowd the tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser, repeater</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td>
			<td>BD</td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation pipette, manual (20-200 &#181;l)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>1057-0200 or 1070-0200</td>
			<td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs, sterile reagent</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>4054-1000</td>
			<td>Anything similar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette, 8-channel (50-1200 &#181;l) (Biohit eLine)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>730391</td>
			<td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &#181;l) (Biohit eLine)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>730361</td>
			<td>Anything similar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369802&#160;</td>
			<td>Anything similar will work for manual plate washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader with absorbance detection</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 250</td>
			<td>Anything similar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgG/IgY</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>I1903-15R</td>
			<td>Also available from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg whites</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>&#8220;All Whites&#8221;, &#8220;Egg Beaters&#8221;, etc.</td>
			<td>Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Trizma Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>2.42 g/L to make TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876&#160;</td>
			<td>1.14 g/L for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>0.2 g/L for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>0.2 g/L for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, EIA grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with 1% BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3688</td>
			<td>Mix 1 packet in 1 L dH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6409</td>
			<td>Mix 100 &#181;l in 50 ml TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td></td>
			<td>Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9046</td>
			<td>Mix 100 ul in 1 L of 1% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6534</td>
			<td>Dilute 125 &#181;l in 1 L PBS-BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Add as last ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td>
			<td>SurModics</td>
			<td>TMBW-1000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

Monitoring geleedpotige beweging is vaak nodig om geassocieerd populatiedynamiek, dispersie patronen, voorkeuren waardplant, en andere ecologische interacties beter te begrijpen. Geleedpotigen worden meestal bijgehouden in de natuur door tagging ze met een uniek merk en vervolgens opnieuw verzamelen ze in de tijd en ruimte om hun verspreiding vermogen te bepalen. Naast de fysieke markeringen, bijvoorbeeld gekleurde stof of verf, verschillende soorten eiwitten hebben bewezen zeer effectief voor het markeren van geleedpotigen ecologische onderzoek. Eiwitten kunnen inwendig en / of uitwendig worden toegediend. De eiwitten kunnen vervolgens worden gedetecteerd ingehaald geleedpotigen met een proteïne-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Hier beschrijven we protocollen voor extern als intern tagging geleedpotigen met eiwit. Twee eenvoudige experimentele voorbeelden worden gedemonstreerd: (1) een intern eiwit merk geïntroduceerd om een ​​insect door een eiwit verrijkte dieet en (2) een externe eiwit topisch een merktekenpplied een insect met een medische verstuiver. Vervolgens hebben we betrekking hebben een stap-voor-stap handleiding van de sandwich en indirecte ELISA methoden die worden gebruikt om eiwitten te merken detecteren op de insecten. In deze demonstratie worden verschillende aspecten van de overname en de detectie van eiwit markers op geleedpotigen merk afgifte-hervangst, mark-capture en soorten self-mark-capture van het onderzoek besproken, samen met de verschillende manieren waarop de immunomarking procedure is geweest aangepast om een ​​groot aantal onderzoeksdoelen passen.

Interne markering: De resultaten van de interne retentie markering proef zijn weergegeven in Figuur 2A. De berekende ELISA kritische drempelwaarde was 0,054. Algemeen (alle vier de sample data gecombineerd), de insecten behandeld zonder eiwit leverde constant laag ELISA waarden (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omgekeerd alle insecten gevoed het eiwit verrijkte voeding le...

Watch this Scientific Journal Video about Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research at JoVE.com

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Research

JoVE Journal

Environment

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Wijziging en toepassing van een bladblazer-vac voor Field Sampling geleedpotigen

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Een flow-through Exposure System voor het evalueren van sedimenten in suspensie Effecten op Aquatic Life

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimenteel protocol voor het opsporen<em&gt; Cyanobacteriën</em&gt; In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protocol voor microplastics bemonstering op het zeeoppervlak en Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

RGB- en spectrale Root Imaging voor Plant fenotypering en fysiologisch onderzoek: experimentele opzet en Imaging protocollen

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Basisonderzoek in Plasma geneeskunde - een benadering van de doorvoer van vloeistoffen naar cellen

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Voorbereiding van DMMTAV DMDTAV met DMAV voor milieutoepassingen: synthese, zuivering en bevestiging

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

De Hawaii-Protocol voor wetenschappelijke Monitoring van koffie Berry Borer: een Model voor koffie Agro-ecosystemen wereldwijd

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

Fok- en lange termijn onderhoud van Eristalis tenax zweefvliegen voor onderzoeken

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...