Name: sex differences in mouse hippocampal astrocytes after in-vitro ischemia
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00
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Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.

NOTA: Este estudio se realizó de conformidad con la recomendación de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El animal protocolo fue aprobado por la Universidad de Wisconsin-Madison, Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Protocolo de cultivo de astrocitos primarios que se presenta aquí se adopta a partir de los protocolos presentados por Zhang Y 19 et al., Y Cengiz P 20 et al., Con algunas modificaciones. 1. La d...

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	<li>Powell, E. M., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+astrocyte-mediated+cues+in+neuronal+guidance+and+process+extension.">Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension.</a> Glia. 26, 73-83 (1999).</li><li>Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li><li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes.">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).</li><li>McClive, P. J., Sinclair, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+DNA+extraction+and+PCR-sexing+of+mouse+embryos.">Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos.</a> Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).</li><li>Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gender+determination+in+newborn+dark+pigmented+mice.">A method for gender determination in newborn dark pigmented mice.</a> Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).</li><li>Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+primary+astrocyte+cultures+devoid+of+contaminating+microglia.">Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia.</a> Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55, 165-177 (2007).</li><li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures.">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PloS one. 8, e60282 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+reactivity+of+mouse+and+rat+astrocytes+in+vitro.">Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro.</a> Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li></ol>

Con el fin de estudiar las diferencias de sexo en las propiedades y funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas y patológicas, la preparación de los astrocitos primarios sexado en cultivo celular es una herramienta importante que se utilice. En el presente estudio se presenta un altamente eficiente y un método reproducible a la cultura de una población homogénea altamente enriquecido de los astrocitos del hipocampo sexado de recién nacido (P0-P2) C57Bl / 6 (de tipo salvaje) o K19F (GFAP nulo) crías d...

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). La creciente cuerpo de evidencia indica que las funciones de los astrocitos son más que proporcionar apoyo neuronal. De hecho, las funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas pueden ser muy complejos, como guía la migración de los axones en desarrollo 1, la regulación de CNS flujo de sangre 2, el mantenimiento de la homeostasis del pH del fluido intersticial sináptica 3, y participar en la barrera hematoencefálica 4 y 5 la transmisión sináptica. En condiciones patológicas, los astrocitos responden a la lesión con un proceso llamado astrogliosis reactiva en la que la morfología, el número, la ubicación, la topografía (con respecto a la distancia de insulto) y la función de los astrocitos pueden cambiar de una manera heterogénea 6,7. Astrogliosis visto después de la encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal puede que contribuye a la morbilidad y la mortalidad de los recién nacidos <shasta&gt; 8. estudios clínicos y experimentales recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo y que los recién nacidos masculinos son más susceptibles a los efectos de la hipoxia / isquemia (HI) lesión cerebral -related, resultando en resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables 9-11. Aunque la localización de la lesión depende de la edad gestacional y la duración y la gravedad de la lesión, el hipocampo es una de las regiones más comúnmente realizada en el SNC después neonatal HI plazo, y astrogliosis hipocampo ha sido confirmado por la sobre regulación de aumento la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d después de la HI neonatal 7,10,12,13. Las diferencias de sexo en función de los astrocitos se muestran en ambos neonatos y roedores adultos después de la isquemia cerebral 14,15. Además, la susceptibilidad astrocytic macho a la isquemia in vitro se demostró por el aumento de cell muerte en comparación con los astrocitos corticales femeninas en la cultura 16. Las diferencias de sexo comienzan en el útero y continúan hasta la muerte 17. Durante la última década, la importancia de incluir los sexos en condiciones experimentales en cultivo celular y estudios in vivo han sido el énfasis del Instituto de Medicina y los NIH para buscar el conocimiento fundamental de las diferencias sexuales observadas en condiciones fisiológicas y patológicas 17,18 . El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones de astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. El presente estudio fue diseñado para proporcionar las técnicas para preparar cultivos de astrocitos del hipocampo sexo-específicas enriquecidas a partir de ratones recién nacidos con el fin de evaluar el papel de los astrocitos GFAP-inmunorreactivas siguientes oxígeno / glucosa Privación (OGD) y reoxigenación (Reox), induciendoHI en el ambiente de cultivo celular. Esta técnica se puede utilizar para probar cualquier hipótesis relativa a los astrocitos del hipocampo en los machos y hembras neonatales en condiciones de normoxia e isquémicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Astrocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>Final Concentration: 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Final Concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Leucine methyl ester hydrochloride</td>
			<td rowspan="2">Aldrich</td>
			<td rowspan="2">L1002-25G</td>
			<td rowspan="2">Final Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solution for brain tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>25-050-CI</td>
			<td>Final Concentration: 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (vol/vol) ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12mm round coverslips&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Sterile cell strainer&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm petri dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, fine&#160;</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>2-1032; 2-1033</td>
			<td># 3c; # 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, flat tip</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-120-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 cm surgical scissors</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC-140-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RSi&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5805000.017</td>
			<td>Centrifuge5804R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE 4450-1CE</td>
			<td>MaxQ 4450&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IBA1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2320</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIF1alpha</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab179483</td>
			<td>rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA015768</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (cocktail)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>Contains 4 Reagents&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sex differences in mouse hippocampal astrocytes after in-vitro ischemia

Astrogliosis siguiente / isquemia (HI) -relacionado lesión cerebral por hipoxia juega un papel en el aumento de la morbilidad y la mortalidad en los recién nacidos. Los estudios clínicos recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo, y que los recién nacidos varones son más susceptibles a los efectos de la lesión cerebral relacionada con HI, dando lugar a resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables. El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones altamente enriquecidas de los astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. En este estudio, se describe un método para crear cultivos de astrocitos de hipocampo específicos del sexo que están sometidos a un modelo de isquemia in vitro, la privación de glucosa en oxígeno, seguido por la reoxigenación. astrogliosis reactiva subsiguiente fue examinado por immunostaiNing para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y S100B. Este método proporciona una herramienta útil para estudiar el papel de los astrocitos del hipocampo masculinos y femeninos siguiente neonatal HI, por separado.

La comprensión de las funciones de las funciones de astrocitos sexado bajo condiciones fisiológicas o fisiopatológicas se han dilucidado inmensamente mediante el cultivo de estas células en condiciones in vitro. El aspecto importante de la realización de cultivo sexuado es determinar el sexo de la cría de ratón antes de su uso. Se determinó el sexo del ratón genéticamente por PCR y por la evaluación visual (Figura 2) 16. La metodología de ...

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Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). Aquí, estamos reportando un método práctico de protocolo de cultivo de astrocitos del hipocampo sexado con el fin de estudiar los mecanismos que subyacen a la función de los astrocitos en cachorros recién nacidos masculinos y femeninos después de la isquemia in vitro.

Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos<em&gt; In-Vitro</em&gt; isquemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modelado astrocitoma Patogénesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Tuning en la banda Theta Hippocampal<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

En Utero Electroporación de marcadores de color multiaconsejables integradores del genoma (MAGIC) para individualizar los astrocitos corticales del ratón

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...