Name: synthesis of thermogelling poly(n-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate composites with alginate microparticles for tissue engineering
Uploaded: 2016-10-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering at JoVE.com

De auteurs willen graag de hulp van Dr. Jennifer Kadlowec dankbaar erkennen in de ontwikkeling van de lijm trekproef protocol. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten en het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering van de National Institutes of Health onder Award Number 1R15 AR 063920-01. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

1. Poly (N-isopropylacrylamide) -g-chondroïtinesulfaat Synthese <ol><li> Voor de synthese van de biologisch hechtende hydrogel, zuiveren N-isopropylacrylamide (NIPAAm) methacrylaat monomeer en chondroïtinesulfaat (CS). <ol><li> Weeg ten minste 10 g NIPAAm en los het monomeer in 400 ml n-hexaan bij 60 ° C. Roer de container periodiek tot volledige oplossing. Herkristalliseer de oplossing in een -20 ° C vriezer gedurende 24 uur. </li><li> Verwijder de gekristalliseerde monomeer uit de houder en vacuümfilter het n-h...

Er zijn verschillende kritische stappen in de synthese van de hydrogel micropartikels composiet en evalueren van de hechtsterkte, zwelling vermogen en cellulaire biocompatibiliteit. Vrije radicaalpolymerisatie van PNIPAAm-G-CS vereist een succesvolle methacrylation chondroïtinesulfaat, volledige oplossing van monomeercomponenten en zuurstofvrije reactiecondities. De verhouding van monomeer tot NIPAAm methacrylbevattend chondroitin sulfaat in het reactiemengsel werd gekozen omdat is aangetoond, in ons eerder werk copoly...

Injecteerbare biomaterialen zijn die gemakkelijk in het lichaam kan worden afgeleverd als een vloeistof en vast in situ. Dergelijke materialen zijn uitgebreid toegepast in de regeneratieve geneeskunde, waar zij worden gebruikt om ingekapselde cellen afleveren op het terrein 1-4 en fungeren als een driedimensionale tijdelijke extracellulaire matrix voor de cellen 5. Voor de patiënt, injecteerbare biomaterialen zijn voordelig omdat de chirurgische procedures voor implantatie zijn minimaal invasieve en de vaste fase kan vullen onregelmatig gevormde weefsel gebreken, waardoor de noodzaak voor aangepast formaat implantaten. Injecteerbaarheid kan worden bereikt door een verscheidenheid van mechanismen. Externe factoren, zoals pH, werden onderzocht als een trigger voor de vorming van gels die cellen en biologisch actieve moleculen 6-8 kapselen. Evenwel pH niet de meest geschikte trekker te gebruiken in alle fysiologische omgevingen. Een ander traditioneel Alternatief voor het bereiken injecteerbaar is door in situ chemische polymerisatie of verknoping. Een groep ontwikkelde een in water oplosbare redox systeem bestaande uit ammoniumpersulfaat en N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethylethyleendiamine en gebruikt voor het laten reageren macromeren bestaat uit polyethyleenglycol en poly (propyleen) glycol 9,10. Zan et al. 11 ontwikkelde injecteerbare chitosan netwerken polyvinylalcohol verknoopt met glutaaraldehyd. Bij dergelijke systemen moet de cytotoxiciteit van reactieve componenten worden gehouden, vooral voor toepassingen in celinkapselende. Ook zou exotherme polymerisatie- temperaturen hoog genoeg produceren omringende weefsel, dat is beschreven voor polymeer botcement 12,13 compromitteren. Nog andere injecteerbare polymere systemen ontwikkeld die een overgang van vloeibare naar vaste toestand met de temperatuur als de trigger vertonen. Bekend als thermogelling systemen, zijn aqueoons polymeeroplossingen die niet behoeft chemische stimulus, monomeren, verknopingsmiddelen of bereiken in situ vorming 14. Eerder een faseovergang zich doorgaans dichtbij fysiologische temperatuur induceert de vorming van een fysisch verknoopt driedimensionaal netwerk. Poloxameren zoals Pluronic F127 behoren tot de meest bestudeerde polymeren voor geneesmiddelafgifte thermogelling 15-17 en celinkapselende 18,19. Het is echter algemeen geaccepteerd dat deze gelen in aan stabiliteit fysiologische omstandigheden. Studies hebben een verhoogde stabiliteit aangetoond met behulp van ketenverlengers 20 of chemische crosslinkers 21,22. Niettemin kan het gebruik van deze reagentia de mogelijkheden van het materiaal voor celinkapselende beperken. Poly (N-isopropylacrylamide) is een synthetisch polymeer thermogelling dat veel aandacht heeft gekregen in tissue engineering en drug delivery 14. Waterige oplossingen van poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) vertonen een lagere kritische temperatuur-oplossing (LCST), typisch optredende rond 32-34 ° C 23,24. Onder de LCST, water hydrateert PNIPAAm ketens. Boven de overgangstemperatuur, wordt het polymeer hydrofobe, wat resulteert in een dramatische fasescheiding 25-27 en de vorming van een vaste gel zonder het gebruik van toxische monomeren en verknopingsmiddelen. Echter, PNIPAAm homopolymeren vertonen slechte elastische eigenschappen en houden weinig water bij fysiologische temperatuur te wijten aan hydrofobiciteit 28. In dit werk, kiezen we chondroïtinesulfaat covalent nemen in de PNIPAAm netwerk, dat het potentieel voor enzymatische afbraak 29, anti-ontstekingsactiviteit 30,31 en verhoogde water- en voedingsopname 32 biedt. PNIPAAm copolymeren CS werden in ons laboratorium bereid door polymeriseren van het monomeer NIPAAm in aanwezigheid van methacrylaat-gefunctionaliseerde CS entcopolymeer (PNIPAAm-g-CS) te vormen. BecAGebruik de lage verknopingsdichtheid van het copolymeer, PNIPAAm-G-CS vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur en een elastische gel bij fysiologische temperatuur dankzij het LCST 29. De polymeeroplossingen worden vloeiend weer na afkoeling onder de LCST als gevolg van de omkeerbaarheid van de overgang. We hebben aangetoond dat PNIPAAm-g-CS heeft de potentie om te functioneren als een scaffold tissue engineering, door mechanische eigenschappen die kunnen worden aangepast, afbreekbaarheid en cytocompatibility met menselijke embryonale nier (HEK) 293-cellen 29. In bepaalde dragende gebieden, zoals de tussenwervelschijf, tissue engineering scaffolds moet in staat zijn een aanzienlijke interface disc omringende weefsel te vormen om het risico van ontwrichting 33 te elimineren. Deze interface is ook noodzakelijk voor een adequate krachtoverbrenging over het grensvlak tussen het implantaat en het weefsel 33. In ons werk, hebben we een opgeschortlginate microdeeltjes in waterige oplossingen van PNIPAAm-G-CS en vond dat geleren lokaliseert de microdeeltjes, die de hechting met het omliggende weefsel 34. In dit artikel schetsen we de stappen voor de voorbereiding van de thermogelling, zelfklevende polymeer. Standaardtechnieken voor biomaterialen en karakterisatie, cell imaging en assays voor levensvatbaarheid werden aangepast om rekening te houden met de temperatuurgevoeligheid van het polymeer en de omkeerbaarheid van de faseovergang. De injecteerbare polymeer beschreven in dit document heeft ruime mogelijkheden voor drug delivery en tissue engineering-toepassingen buiten de in dit document beschreven. Bovendien kan de karakterisering werkwijzen beschreven voor andere thermogelling systemen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">2210-25-5</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate and remove stabilier with hexane</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">39455-18-0</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Hexanes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">H302-4</td>
			<td style="width:347px;">Store in a flammable cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">50% (w/w) sodium hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">SS254-1</td>
			<td style="width:347px;">Caustic in nature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Methacrylic anhydride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">276685</td>
			<td style="width:347px;">Strong fumes; use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Acetone</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A18-4</td>
			<td style="width:347px;">Chill in a refrigerator prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Nitrogen Gas</td>
			<td style="width:164px;">Praxair</td>
			<td style="width:120px;">7727-37-9</td>
			<td style="width:347px;">Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">110-18-9</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3678</td>
			<td style="width:347px;">Hygroscopic and degrades in the presence of water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP2944</td>
			<td style="width:347px;">Keep dry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Alginic acid, sodium salt</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">177775000</td>
			<td style="width:347px;">Use heat to aid in dissolving</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">C79</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Canola oil</td>
			<td style="width:164px;">Local store</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Obtain from a local store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">93773</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">70% (v/v) Isopropoanol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A416-4</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Porcine ears</td>
			<td style="width:164px;">Haine&#39;s Pork Shop</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Obtain from a local butcher</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S271-3</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Human embryonic kidney 293 cells</td>
			<td style="width:164px;">ATCC</td>
			<td style="width:120px;">ATCC CRL-1573</td>
			<td style="width:347px;">Store in liquid nitrogen for long-term use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11965126</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10082-147</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Penn Strep: 10,000 U/ml</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140-122</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15400-054</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">AAA44571-K7</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Live/Dead Cell viability kit</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">L3224</td>
			<td style="width:347px;">Light sensitive, keep frozen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">XTT cell viability kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">TOX2-1KT</td>
			<td style="width:347px;">Light sensitive, keep frozen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">21063-029</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Dulbecco&#39;s PBS: 1X</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">14190136</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:164px;">EMD</td>
			<td style="width:120px;">SX0445-1</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Positive displacement pipette</td>
			<td style="width:164px;">BrandTech Scientific, INC</td>
			<td style="width:120px;">2702904</td>
			<td style="width:347px;">Dispenses 100 - 500 &#181;L and comes with attachable tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">No 3. Stainless Steel scalpel handle</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S2896</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Miltex sterile surgical blades</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">12-460-440</td>
			<td style="width:347px;">Size 10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Power gem homogenizer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">08-451-660</td>
			<td style="width:347px;">Model # 125</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Porcelain mortar and pestle</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">Z247464</td>
			<td style="width:347px;">Holds 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">FreeZone 1 L benchtop freeze dry system</td>
			<td style="width:164px;">Labconco</td>
			<td style="width:120px;">7740020</td>
			<td style="width:347px;">Freeze samples prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Oil sealed rotary vane pump</td>
			<td style="width:164px;">Edwards</td>
			<td style="width:120px;">A65301906</td>
			<td style="width:347px;">Model # RV5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Incubating orbital shaker</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">12620-946</td>
			<td style="width:347px;">Model # 980153</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Forma Scientific, INC</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 5682</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Heated ovens</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td></td>
			<td style="width:347px;">Model # 1235PC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">2 N force gauge</td>
			<td style="width:164px;">Shimpo</td>
			<td style="width:120px;">FGV-0.5XY</td>
			<td style="width:347px;">Model # FGV-0.5XY</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">E-force test stand</td>
			<td style="width:164px;">Shimpo</td>
			<td style="width:120px;">FGS-200PV</td>
			<td style="width:347px;">Model # FGS-200PV</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tissue culture swinging bucket centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:120px;">366830</td>
			<td style="width:347px;">Model #6S-6KR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tissue culture microcentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model #5415C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Hemacytometer set</td>
			<td style="width:164px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:120px;">3720</td>
			<td style="width:347px;">Requires replacement cover glass slips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Slide warmer</td>
			<td style="width:164px;">Lab Scientific</td>
			<td style="width:120px;">XH-2022</td>
			<td style="width:347px;">Model # XH-2002</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Portable heating lamp</td>
			<td style="width:164px;">Underwriters Laboratories</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Helps to maintain polymer temperature at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Inverted fluorescent microscope</td>
			<td style="width:164px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model Axiovert 25 CFL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Heated water bath</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 1235PC</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Rocking platform</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Series 100</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Multiskan FC microtiter plate reader</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Type 357</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 2350T</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Purifier class II biosafety cabinet</td>
			<td style="width:164px;">Labconco</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Delta Series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of thermogelling poly(n-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate composites with alginate microparticles for tissue engineering

Injecteerbare biomaterialen worden gedefinieerd als implanteerbare materialen die in het lichaam als een vloeistof kan worden ingebracht en in situ stollen. Dergelijke materialen bieden klinische voordelen worden geïmplanteerd minimaal invasief en gemakkelijk vorming ruimtevullende vaste deeltjes onregelmatig gevormde defecten. Injecteerbare biomaterialen zijn op grote schaal onderzocht als scaffolds voor tissue engineering. Voor het herstel van bepaalde dragende gebieden van het lichaam, zoals de tussenwervelschijf, steigers moeten hechtende eigenschappen bezitten. Dit zal de kans op dislocatie te minimaliseren tijdens beweging en ervoor innig contact met het omringende weefsel, die voldoende krachtoverdracht. Hier beschrijven we de bereiding en karakterisering van een steiger bestaande uit thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) en alginaat microdeeltjes. De PNIPAAm-g-CS copolymeer vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur, waarin alginate deeltjes gesuspendeerd om de hechting te verbeteren. Boven de onderste kritische oplostemperatuur (LCST), ongeveer 30 ° C, het copolymeer vormt een vaste gel rond de microdeeltjes. We hebben standaard biomaterialen karakterisering procedures aangepast om rekening te houden met de omkeerbare faseovergang van PNIPAAm-G-CS. Resultaten geven aan dat de opname van 50 of 75 mg / ml alginaat deeltjes in 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS oplossingen verviervoudigen de hechtkracht van PNIPAAm-GCS alleen (p &lt;0,05). De opname van alginaatmicrodeeltjes significante toename zwelvermogen van PNIPAAm-G-CS (p &lt;0,05), waardoor een ruimtevullende gel binnen weefseldefecten handhaven. Tenslotte resultaten van de in vitro toxicologie testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) en Live / Dead levensvatbaarheid-assay duiden dat de kleefstof ingezet worden in de overleving en proliferatie van ingekapselde humane embryonale nier (HEK) 293 cells over 5 dagen.

Een thermisch gevoelige geënte copolymeer werd met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd op de bioadhesieve sterkte, zwelvermogen en in vitro cytocompatibility. We kozen ervoor om alginaat te onderzoeken vanwege de gerenommeerde slijmvlieshechtende eigenschappen. Alginaatmicrodeeltjes, met een gemiddelde diameter van 59,7 ± 14,9 urn, werden gemengd met 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS in concentraties van 25, 50 en 75 mg / ml. Deze concentraties waren gebaseerd op de helft, gelijk...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering at JoVE.com

Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

The overall goal of this methodology is to assess both the adhesive properties and cellular biocompatibility of the proposed hydrogel composite for intervertebral disc tissue engineering of the nucleus pulposus. This method can help answer key questions in the field of tissue engineering, like how to design and prepare thermal reversible hydrogels with bioadhesive properties for cell encapsulation. The main advantage of this technique is that we are able to demonstrate in-vitro studies with an injectable, thermally-sensitive composite to evaluate its use as a potential replacement for the nucleus pulposus.In this current study, we evaluate a novel hydrogel scaffold by performing both tensile mechanical tests, and cellular viability assays. Demonstrating the biocompatibility assays will be Emily Schmidt, Mark Dittmer, Edward Goldschmidt, and Frantzeska Giginis, students from the departments of Biological Sciences and Biochemistry. Prior to the synthesis of the bioadhesive hydrogel, purify NIPAAm monomer and mCS, as described in the text protocol.Then, co-dissolve 10 grams of purified NIPAAm and 2.209 grams of mCS in 232 milliliters of deionized water. Purge the solution of oxygen by using inert nitrogen gas. Maintain a vigorous, yet low gas flow rate, to prevent the solution from bubbling over for 15 minutes.Continue purging the solution with nitrogen gas and add 0.976 milliliters of TEMED. Next, initiate the polymerization reaction by mixing 97.6 milligrams of ammonium persulfate. Mix the solution for approximately 20 seconds, and quickly seal the solution to prevent any air from entering the vessel.Allow the solution to polymerize under fluorescent light for 24 hours before processing the sample into a fine powder, as described in the text protocol. Create an oil and water mixture by combining 100 milliliters of canola oil, one milliliters TWEEN 20, and 20 milliliters of 2%of alginate. Emulsify the mixture for 10 minutes with a homogenizer at 15, 000 RPM.Additionally, mix with a magnetic stir bar at 200 RPM to create large microparticles, or 2, 000 RPM to create small microparticles. Aspirate the 2%calcium chloride solution using a syringe with an 18-gauge needle tip. Slowly add the calcium chloride drop-wise into the emulsion.After allowing the microparticles to cross-link for 10 minutes, evenly distribute the batch of microparticles into capped 50 milliliter conical tubes. Centrifuge at 1, 400 times G for two minutes to remove the initial layer of canola oil before washing and lyophilizing the microparticles as described in the text protocol. Use the resulting freeze-dried polymer powder to create a 5%weight volume PNIPPAm graft CS solution by first dissolving 50 milligrams of hydrogel powder in one milliliter of 1X phosphate buffered saline, or PBS.Mix the solution using a vortexer before chilling in a refrigerator at four degrees Celsius for 24 hours. Once the viscous solution forms, create a homogenous composite by adding 25 or 50 milligrams of freeze-dried alginate microparticles to the hydrogel solution and vortexing. Store the composite in a refrigerator at four degrees Celsius for later use.Prior to performing tensile tests, extract cartilage substrate from a porcine ear, as detailed in the text protocol. Then, attach the force gauge to the arm of the test stand. Place a hotplate on top of the force stand, and set the temperature to 50 degrees Celsius.Then, affix a one centimeter by one centimeter piece of cartilage to the stainless steel block with cyanoacrylate glue and a pair of tweezers. Glue an additional piece of cartilage to the Delrin cylinder, and attach the cylinder to the force gauge. It is very important that both cartilage surfaces face each other and contact the hydrogel.Place the plexiglass water bath on top of the hotplate, and insert the stainless steel block with the cartilage substrate inside the bath. Lower the arm of the test stand, and align both cartilage substrates with one another. Then, raise the arm, leaving enough room to apply the hydrogel.With a positive displacement pipette, dispense 200 microliters of the bioadhesive hydrogel to the bottom piece of cartilage. Lower the arm of the force stand at one milliliter per minute until the hydrogel contacts the upper piece of cartilage, and exerts a preload force of 0.001 newtons. Pour the 37-degrees Celsius saline solution into the bath until the volume reaches the designated water level.Check the temperature of the solution with a thermocouple. After allowing the hydrogel to set for a total of five minutes, raise the arm at a speed of two millimeters per minute. The test is completed once the bioadhesive detaches from the cartilage substrate, or when a significant drop in force occurs, signaling failure.Collect the recorded data, and raise the arm of the test stand. Remove the Delrin cylinder from the force gauge. Pour the saline solution into its previous container, and reheat to 37 degrees Celsius.Calculate the stresses, as described in the text protocol. Before performing the Live/Dead assay with PNIPAAm graft CS, prepare human embryonic kidney, or HEK 293 cells, as detailed in the text protocol. Create positive control monolayers by pipetting multiple 300-microliter volumes of the cell mixture into a 24-well plate to generate four to six replicate samples.Maintain the same cell concentration by re-suspending the cells in approximately two milliliters of PNIPAAm graft CS for each replicate sample. Pipette the polymer cell mixture up and down using a serological pipette until homogenous. If seeding with alginate microparticles, transfer two milliliters of the PNIPAAm graft CS cell suspension into a 35-millimeter culture dish, and introduce 200 milligrams of particles into the mixture.Pipette the cell mixture up and down using a serological pipette until homogenous. Then, with a serological pipette, dispense multiple 300-microliters volumes of the polymer cell mixture into each of the wells for killed control, PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles to generate four to six replicate samples. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 10 to 15 minutes, and allow the PNIPAAm graft CS to transition from a liquid to a gel.The polymer forms an opaque white disc. Position a slide warmer in the hood, and set the temperature to 37 degrees Celsius. Use the slide warmer to maintain well plate temperature, and pipette 600 microliters of pre-warmed media into each well.To further prevent the transitioning of the polymer to a liquid state, position a lamp with a fluorescent bulb above the dish to warm up the air above it. Incubate the cells for five days at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. After five days have elapsed, remove the media from the wells of the monolayer, PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles.Wash all of the wells thoroughly, but gently, with PBS, and then, remove the PBS. Allow the hydrogel discs containing alginate microparticles to liquefy at room temperature, and add two milliliters of 50 millimolar sodium citrate to each of the wells. Remove the media from the killed cell wells.Allow the hydrogel discs to liquefy at room temperature, and add 300 microliters of 70%methanol to each well before incubating the plate for 45 minutes at 37 degrees Celsius. Remove the sodium citrate and methanol solutions from the wells, and pipette each of the hydrogel suspensions into individual microcentrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 2, 000 times G for 10 minutes to separate the cells from the hydrogel suspension.Carefully remove the suspension by pipetting the solution from the conical tube, and leaving behind the cell pellet. Re-suspend the pellet in 300 microliters of PBS, and transfer to the original well plate. Next, add 300 microliters of the Live/Dead dye mix to each of the wells.Wrap the well plate in aluminum foil, and incubate for 45 minutes on a rocker at room temperature before imaging all of the samples under an inverted fluorescence microscope with a 10X objective. Representative tensile strength results for both PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with varying alginate microparticle formulations are shown here. The tensile strength of PNIPAAm graft CS quadrupled with the addition of 50 or 75 milligrams per milliliter of alginate microparticles.As expected, PNIPAAm graft CS contracts and shrinks in volume above its lower critical solution temperature. Introducing microparticles within the hydrogel imparts a swelling effect over a seven-day period in PBS. HEK 293 cells encapsulated in both PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles showed active cellular fluorescence using Live/Dead dye after a period of five days.These results can be compared to the positive and negative control wells. In parallel, a quantitative assay was used to confirm the Live/Dead imaging, which showed no significant differences in cellular viability between PNIPAAm graft CS, PNIPAAm graft CS with alginate microparticles, and the control monolayer. A hydrogel composite consisting of thermally-sensitive poly(N-isopropylacrylamide)grafted with chondroitin sulfate and alginate microparticles was created for nucleus pulposus replacement.While attempting this procedure, it's important to remember that the composite is temperature-sensitive, and will liquefy below its lower critical solution temperature. Once mastered, tensile mechanical tests can be performed with ease as long as careful precision is practiced. Swelling studies reveal a hydrogel's ability to retain water.However, these tests must mimic the native in-vivo environment. Cellular viability of the thermally-sensitive gels can be confirmed and assessed by a combination of fluorescence-marking and metabolic-producing reagents. After watching this video, you should have a good understanding of how thermally-sensitive injectables are applied in intervertebral discs, tissue engineering, and how composites may enhance certain material properties.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Voorbereiding van de thermoresponsieve nanogestructureerde oppervlakken voor Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...