Name: synthesis of thermogelling poly(n-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate composites with alginate microparticles for tissue engineering
Uploaded: 2016-10-26T12:30:00
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Os autores gostariam de reconhecer com gratidão a ajuda do Dr. Jennifer Kadlowec no desenvolvimento do protocolo de ensaio de tração adesivo. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e doenças osteomusculares e de pele e do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número 1R15 AR 063920-01. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. O poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntese <ol><li> Antes da síntese do hidrogel bioadesivo, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) e monómero de metacrilato de sulfato de condroitina (CS). <ol><li> Pesar, pelo menos, 10 g de NIPAAm e dissolve-se o monómero em 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Agita-se o recipiente periodicamente até à dissolução completa. Recristaliza-se a solução num congelador a -20 ° C durante 24 h. </li><li> Remover o monómero cristalizado a partir de o filtro e...

Há vários passos críticos em sintetizar o composto hidrogel-micropartículas e avaliar a sua força adesiva, inchaço capacidade e biocompatibilidade celular. polimerização de radical livre de PNIPAAm-g-CS requer metacrilaï¿½ï¿½o bem sucedida de sulfato de condroitina, a dissolução completa dos componentes de monómero, e das condições de reacção sem oxigénio. A razão de monómero para NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado na mistura de reacção foi escolhida porque foi demonstrado, no nosso trab...

Biomateriais injectáveis são aqueles que podem ser convenientemente entregues para o corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais têm sido extensivamente aplicado na medicina regenerativa, em que eles são utilizados para entregar células encapsuladas para o local afectado 1-4 e actuam como uma matriz extracelular temporária tridimensional para as células 5. Para o paciente, biomateriais injectáveis ​​são vantajosos porque os procedimentos cirúrgicos para implante são minimamente invasiva e a fase sólida pode preencher defeitos de forma irregular dos tecidos, eliminando a necessidade de implantes de tamanho personalizado. Injectabilidade pode ser conseguido através de uma variedade de mecanismos. Os factores externos, como pH, têm sido investigadas como um gatilho para a formação de geles que encapsulam as células e moléculas bioactivas 6-8. No entanto, o pH não pode ser o gatilho mais conveniente para utilizar em todos os ambientes fisiológicos. Outra alterna tradicionaltiva para atingir injectabilidade está usando polimerização in situ química ou reticulação. Um grupo desenvolvido um sistema redox solúvel em água composto por persulfato de amónio e N, N, N-tetrametiletilenodiamina, N &#39;, e é utilizado para a reacção de macrómeros compostas de polietileno glicol e poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano injectáveis de álcool polivinílico reticulado com glutaraldeído desenvolvidos. Em tais sistemas, a citotoxicidade dos componentes reactivos deve ser considerada, especialmente para aplicações que envolvem o encapsulamento celular. Além disso, a polimerização exotérmica pode produzir temperaturas elevadas o suficiente para comprometer o tecido circundante, o que tem sido relatado para o osso polimérico cimentos 12,13. Ainda outros sistemas de polímeros injectáveis ​​têm sido desenvolvidos que exibem uma mudança do estado líquido para estado sólido com a temperatura como o gatilho. Conhecido como sistemas termogelificantes, estes são aqueonos soluções de polímero que não requerem estímulo químico, monómeros ou agentes de ligação cruzada para conseguir a formação in situ 14. Em vez disso, uma transição de fase que ocorre geralmente próxima da temperatura fisiológica induz a formação de uma rede tridimensional fisicamente reticulado. Poloxâmeros como Pluronic F127 estão entre os polímeros mais estudados para termogelificantes entrega da droga 15-17 e células encapsulamento 18,19. No entanto, é bem aceite que estes geles não possuem a estabilidade em condições fisiológicas. Estudos têm demonstrado o aumento da estabilidade usando extensores de cadeia ou agentes de reticulação químicos 20 21,22. No entanto, a utilização destes reagentes pode limitar o potencial dos materiais de encapsulamento de células. Poli (N-isopropilacrilamida) é um polímero sintético termogelificantes que tem recebido uma atenção significativa em engenharia de tecidos e entrega de droga 14. As soluções aquosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), tipicamente ocorrendo em torno de 32-34 ° C 23,24. Abaixo da TCIS, água hidrata cadeias de PNIPAAm. Acima da temperatura de transição, o polímero torna-se hidrofóbico, resultando numa separação de fases dramática 25-27 e formação de um gel sólido, sem o uso de monómeros ou agentes de reticulação tóxicos. No entanto, homopolímeros de PNIPAAm exibem pobres propriedades elásticas e mantenha pouco de água à temperatura fisiológica devido à hidrofobicidade 28. Neste trabalho, nós optar por incorporar sulfato de condroitina covalente na rede PNIPAAm, que oferece o potencial para degradabilidade enzimática 29, a actividade anti-inflamatória 30,31, e aumento da água e absorção de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm com CS foram preparados no nosso laboratório por polimerização do monómero NIPAAm na presença de CS-metacrilato funcionalizado para formar copolímero enxertado (PNIPAAm-g-CS). BecAUtilize de baixa densidade de reticulação do copolímero, PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, e um gel elástico à temperatura fisiológica devido à TCIS 29. As soluções de polímero se tornar fluido novamente após o arrefecimento abaixo da TCIS, devido à reversibilidade da transição. Nós demonstramos que PNIPAAm-g-CS tem o potencial para funcionar como uma estrutura de engenharia de tecidos, devido às propriedades mecânicas que podem ser adaptados, degradabilidade e citocompatibilidade com rim embrionário humano (HEK) 293 células 29. No entanto, em determinadas áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, andaimes de engenharia de tecidos devem possuir a capacidade de formar uma interface substancial com o tecido envolvente do disco para eliminar o risco de deslocamento 33. Esta interface é também necessário para uma adequada transmissão de força em toda a interface entre o implante e o tecido 33. Em nosso trabalho, temos que suspendeu amicropartículas lginate em soluções aquosas de PNIPAAm-g-CS e descobriram que a gelificação localiza as micropartículas, que proporcionam a adesão com o tecido circundante 34. Neste artigo, vamos delinear os passos para a preparação do termogelificantes, polímero adesivo. As técnicas convencionais para a caracterização de biomateriais, imagens de células, e os ensaios de viabilidade foram adaptados para ter em conta a sensibilidade à temperatura do polímero e a reversibilidade da transição de fase. O polímero injetável descrito neste trabalho tem grande potencial para aplicações de entrega de medicamentos e engenharia de tecidos fora dos descritos neste documento. Além disso, os métodos de caracterização descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">2210-25-5</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate and remove stabilier with hexane</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">39455-18-0</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Hexanes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">H302-4</td>
			<td style="width:347px;">Store in a flammable cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">50% (w/w) sodium hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">SS254-1</td>
			<td style="width:347px;">Caustic in nature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Methacrylic anhydride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">276685</td>
			<td style="width:347px;">Strong fumes; use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Acetone</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A18-4</td>
			<td style="width:347px;">Chill in a refrigerator prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Nitrogen Gas</td>
			<td style="width:164px;">Praxair</td>
			<td style="width:120px;">7727-37-9</td>
			<td style="width:347px;">Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">110-18-9</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3678</td>
			<td style="width:347px;">Hygroscopic and degrades in the presence of water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP2944</td>
			<td style="width:347px;">Keep dry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Alginic acid, sodium salt</td>
			<td style="width:164px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:120px;">177775000</td>
			<td style="width:347px;">Use heat to aid in dissolving</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">C79</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Canola oil</td>
			<td style="width:164px;">Local store</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Obtain from a local store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">93773</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">70% (v/v) Isopropoanol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A416-4</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Porcine ears</td>
			<td style="width:164px;">Haine&#39;s Pork Shop</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Obtain from a local butcher</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S271-3</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Human embryonic kidney 293 cells</td>
			<td style="width:164px;">ATCC</td>
			<td style="width:120px;">ATCC CRL-1573</td>
			<td style="width:347px;">Store in liquid nitrogen for long-term use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11965126</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10082-147</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Penn Strep: 10,000 U/ml</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140-122</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15400-054</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">AAA44571-K7</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Live/Dead Cell viability kit</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">L3224</td>
			<td style="width:347px;">Light sensitive, keep frozen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">XTT cell viability kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">TOX2-1KT</td>
			<td style="width:347px;">Light sensitive, keep frozen</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">21063-029</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Dulbecco&#39;s PBS: 1X</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">14190136</td>
			<td style="width:347px;">Refrigerate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:164px;">EMD</td>
			<td style="width:120px;">SX0445-1</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Positive displacement pipette</td>
			<td style="width:164px;">BrandTech Scientific, INC</td>
			<td style="width:120px;">2702904</td>
			<td style="width:347px;">Dispenses 100 - 500 &#181;L and comes with attachable tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">No 3. Stainless Steel scalpel handle</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S2896</td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Miltex sterile surgical blades</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">12-460-440</td>
			<td style="width:347px;">Size 10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Power gem homogenizer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">08-451-660</td>
			<td style="width:347px;">Model # 125</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Porcelain mortar and pestle</td>
			<td style="width:164px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">Z247464</td>
			<td style="width:347px;">Holds 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">FreeZone 1 L benchtop freeze dry system</td>
			<td style="width:164px;">Labconco</td>
			<td style="width:120px;">7740020</td>
			<td style="width:347px;">Freeze samples prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Oil sealed rotary vane pump</td>
			<td style="width:164px;">Edwards</td>
			<td style="width:120px;">A65301906</td>
			<td style="width:347px;">Model # RV5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Incubating orbital shaker</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;">12620-946</td>
			<td style="width:347px;">Model # 980153</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Forma Scientific, INC</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 5682</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Heated ovens</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td></td>
			<td style="width:347px;">Model # 1235PC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">2 N force gauge</td>
			<td style="width:164px;">Shimpo</td>
			<td style="width:120px;">FGV-0.5XY</td>
			<td style="width:347px;">Model # FGV-0.5XY</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">E-force test stand</td>
			<td style="width:164px;">Shimpo</td>
			<td style="width:120px;">FGS-200PV</td>
			<td style="width:347px;">Model # FGS-200PV</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tissue culture swinging bucket centrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:120px;">366830</td>
			<td style="width:347px;">Model #6S-6KR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Tissue culture microcentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model #5415C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Hemacytometer set</td>
			<td style="width:164px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:120px;">3720</td>
			<td style="width:347px;">Requires replacement cover glass slips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Slide warmer</td>
			<td style="width:164px;">Lab Scientific</td>
			<td style="width:120px;">XH-2022</td>
			<td style="width:347px;">Model # XH-2002</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Portable heating lamp</td>
			<td style="width:164px;">Underwriters Laboratories</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Helps to maintain polymer temperature at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Inverted fluorescent microscope</td>
			<td style="width:164px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model Axiovert 25 CFL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Heated water bath</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 1235PC</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Rocking platform</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Series 100</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Multiskan FC microtiter plate reader</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Type 357</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Model # 2350T</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:255px;">Purifier class II biosafety cabinet</td>
			<td style="width:164px;">Labconco</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:347px;">Delta Series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of thermogelling poly(n-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate composites with alginate microparticles for tissue engineering

Biomateriais injectáveis são definidos como materiais implantáveis que podem ser introduzidos no corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais oferecem as vantagens clínicas de serem implantados minimamente invasiva e facilmente formando sólidos de preenchimento de espaço em defeitos de forma irregular. biomateriais injetáveis ​​têm sido amplamente investigados como suportes para engenharia de tecidos. No entanto, para a reparação de determinadas zonas de suporte de carga no corpo, tais como o disco intervertebral, andaimes devem possuir propriedades adesivas. Isto vai minimizar o risco de deslocamento durante o movimento e assegurar o contacto íntimo com o tecido circundante, fornecendo a transmissão adequada das forças. Aqui, descrevemos a preparação e caracterização de um andaime composto por termicamente sensíveis poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina -graft-(PNIPAAm-g-CS) e micropartículas de alginato. O copolímero de PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, em que alginate as partículas são suspensas para aumentar a adesão. Acima da temperatura crítica inferior de solução (TCIS), cerca de 30 ° C, o copolímero forma um gel sólido em volta das micropartículas. Temos adaptado biomateriais procedimentos normalizados de caracterização para tomar em consideração a transição de fase reversível de PNIPAAm-g-CS. Os resultados indicam que a incorporação de 50 ou 75 mg / ml de partículas de alginato em 5% (w / v) de soluções PNIPAAm-g-CS quadruplicar a resistência à tracção adesiva de PNIPAAm-GCS sozinhos (p &lt;0,05). A incorporação de micropartículas de alginato também aumenta significativamente a capacidade de inchamento de PNIPAAm-g-CS (p &lt;0,05), ajudando a manter um gel de enchimento dentro do espaço de defeitos de tecidos. Finalmente, os resultados do ensaio in vitro kit de toxicologia, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) e ensaio de viabilidade vivo / morto indicam que o adesivo é capaz de suportar a sobrevivência e proliferação de encapsulado de rim embrionário humano (HEK) 293 Cells mais de 5 dias.

Um co-polímero enxertado de resposta térmica foi sintetizado com sucesso e caracterizado pela sua força bioadesiva, propriedades de intumescimento, e em citocompatibilidade vitro. Nós escolhemos para investigar alginato devido às suas propriedades mucoadesivas bem estabelecidos. As micropartículas de alginato, com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM, foram misturados com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, em concentrações de 25, 50, e 75 mg / ml. Estas concentrações ...

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Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

The overall goal of this methodology is to assess both the adhesive properties and cellular biocompatibility of the proposed hydrogel composite for intervertebral disc tissue engineering of the nucleus pulposus. This method can help answer key questions in the field of tissue engineering, like how to design and prepare thermal reversible hydrogels with bioadhesive properties for cell encapsulation. The main advantage of this technique is that we are able to demonstrate in-vitro studies with an injectable, thermally-sensitive composite to evaluate its use as a potential replacement for the nucleus pulposus.In this current study, we evaluate a novel hydrogel scaffold by performing both tensile mechanical tests, and cellular viability assays. Demonstrating the biocompatibility assays will be Emily Schmidt, Mark Dittmer, Edward Goldschmidt, and Frantzeska Giginis, students from the departments of Biological Sciences and Biochemistry. Prior to the synthesis of the bioadhesive hydrogel, purify NIPAAm monomer and mCS, as described in the text protocol.Then, co-dissolve 10 grams of purified NIPAAm and 2.209 grams of mCS in 232 milliliters of deionized water. Purge the solution of oxygen by using inert nitrogen gas. Maintain a vigorous, yet low gas flow rate, to prevent the solution from bubbling over for 15 minutes.Continue purging the solution with nitrogen gas and add 0.976 milliliters of TEMED. Next, initiate the polymerization reaction by mixing 97.6 milligrams of ammonium persulfate. Mix the solution for approximately 20 seconds, and quickly seal the solution to prevent any air from entering the vessel.Allow the solution to polymerize under fluorescent light for 24 hours before processing the sample into a fine powder, as described in the text protocol. Create an oil and water mixture by combining 100 milliliters of canola oil, one milliliters TWEEN 20, and 20 milliliters of 2%of alginate. Emulsify the mixture for 10 minutes with a homogenizer at 15, 000 RPM.Additionally, mix with a magnetic stir bar at 200 RPM to create large microparticles, or 2, 000 RPM to create small microparticles. Aspirate the 2%calcium chloride solution using a syringe with an 18-gauge needle tip. Slowly add the calcium chloride drop-wise into the emulsion.After allowing the microparticles to cross-link for 10 minutes, evenly distribute the batch of microparticles into capped 50 milliliter conical tubes. Centrifuge at 1, 400 times G for two minutes to remove the initial layer of canola oil before washing and lyophilizing the microparticles as described in the text protocol. Use the resulting freeze-dried polymer powder to create a 5%weight volume PNIPPAm graft CS solution by first dissolving 50 milligrams of hydrogel powder in one milliliter of 1X phosphate buffered saline, or PBS.Mix the solution using a vortexer before chilling in a refrigerator at four degrees Celsius for 24 hours. Once the viscous solution forms, create a homogenous composite by adding 25 or 50 milligrams of freeze-dried alginate microparticles to the hydrogel solution and vortexing. Store the composite in a refrigerator at four degrees Celsius for later use.Prior to performing tensile tests, extract cartilage substrate from a porcine ear, as detailed in the text protocol. Then, attach the force gauge to the arm of the test stand. Place a hotplate on top of the force stand, and set the temperature to 50 degrees Celsius.Then, affix a one centimeter by one centimeter piece of cartilage to the stainless steel block with cyanoacrylate glue and a pair of tweezers. Glue an additional piece of cartilage to the Delrin cylinder, and attach the cylinder to the force gauge. It is very important that both cartilage surfaces face each other and contact the hydrogel.Place the plexiglass water bath on top of the hotplate, and insert the stainless steel block with the cartilage substrate inside the bath. Lower the arm of the test stand, and align both cartilage substrates with one another. Then, raise the arm, leaving enough room to apply the hydrogel.With a positive displacement pipette, dispense 200 microliters of the bioadhesive hydrogel to the bottom piece of cartilage. Lower the arm of the force stand at one milliliter per minute until the hydrogel contacts the upper piece of cartilage, and exerts a preload force of 0.001 newtons. Pour the 37-degrees Celsius saline solution into the bath until the volume reaches the designated water level.Check the temperature of the solution with a thermocouple. After allowing the hydrogel to set for a total of five minutes, raise the arm at a speed of two millimeters per minute. The test is completed once the bioadhesive detaches from the cartilage substrate, or when a significant drop in force occurs, signaling failure.Collect the recorded data, and raise the arm of the test stand. Remove the Delrin cylinder from the force gauge. Pour the saline solution into its previous container, and reheat to 37 degrees Celsius.Calculate the stresses, as described in the text protocol. Before performing the Live/Dead assay with PNIPAAm graft CS, prepare human embryonic kidney, or HEK 293 cells, as detailed in the text protocol. Create positive control monolayers by pipetting multiple 300-microliter volumes of the cell mixture into a 24-well plate to generate four to six replicate samples.Maintain the same cell concentration by re-suspending the cells in approximately two milliliters of PNIPAAm graft CS for each replicate sample. Pipette the polymer cell mixture up and down using a serological pipette until homogenous. If seeding with alginate microparticles, transfer two milliliters of the PNIPAAm graft CS cell suspension into a 35-millimeter culture dish, and introduce 200 milligrams of particles into the mixture.Pipette the cell mixture up and down using a serological pipette until homogenous. Then, with a serological pipette, dispense multiple 300-microliters volumes of the polymer cell mixture into each of the wells for killed control, PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles to generate four to six replicate samples. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 10 to 15 minutes, and allow the PNIPAAm graft CS to transition from a liquid to a gel.The polymer forms an opaque white disc. Position a slide warmer in the hood, and set the temperature to 37 degrees Celsius. Use the slide warmer to maintain well plate temperature, and pipette 600 microliters of pre-warmed media into each well.To further prevent the transitioning of the polymer to a liquid state, position a lamp with a fluorescent bulb above the dish to warm up the air above it. Incubate the cells for five days at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. After five days have elapsed, remove the media from the wells of the monolayer, PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles.Wash all of the wells thoroughly, but gently, with PBS, and then, remove the PBS. Allow the hydrogel discs containing alginate microparticles to liquefy at room temperature, and add two milliliters of 50 millimolar sodium citrate to each of the wells. Remove the media from the killed cell wells.Allow the hydrogel discs to liquefy at room temperature, and add 300 microliters of 70%methanol to each well before incubating the plate for 45 minutes at 37 degrees Celsius. Remove the sodium citrate and methanol solutions from the wells, and pipette each of the hydrogel suspensions into individual microcentrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 2, 000 times G for 10 minutes to separate the cells from the hydrogel suspension.Carefully remove the suspension by pipetting the solution from the conical tube, and leaving behind the cell pellet. Re-suspend the pellet in 300 microliters of PBS, and transfer to the original well plate. Next, add 300 microliters of the Live/Dead dye mix to each of the wells.Wrap the well plate in aluminum foil, and incubate for 45 minutes on a rocker at room temperature before imaging all of the samples under an inverted fluorescence microscope with a 10X objective. Representative tensile strength results for both PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with varying alginate microparticle formulations are shown here. The tensile strength of PNIPAAm graft CS quadrupled with the addition of 50 or 75 milligrams per milliliter of alginate microparticles.As expected, PNIPAAm graft CS contracts and shrinks in volume above its lower critical solution temperature. Introducing microparticles within the hydrogel imparts a swelling effect over a seven-day period in PBS. HEK 293 cells encapsulated in both PNIPAAm graft CS, and PNIPAAm graft CS with alginate microparticles showed active cellular fluorescence using Live/Dead dye after a period of five days.These results can be compared to the positive and negative control wells. In parallel, a quantitative assay was used to confirm the Live/Dead imaging, which showed no significant differences in cellular viability between PNIPAAm graft CS, PNIPAAm graft CS with alginate microparticles, and the control monolayer. A hydrogel composite consisting of thermally-sensitive poly(N-isopropylacrylamide)grafted with chondroitin sulfate and alginate microparticles was created for nucleus pulposus replacement.While attempting this procedure, it's important to remember that the composite is temperature-sensitive, and will liquefy below its lower critical solution temperature. Once mastered, tensile mechanical tests can be performed with ease as long as careful precision is practiced. Swelling studies reveal a hydrogel's ability to retain water.However, these tests must mimic the native in-vivo environment. Cellular viability of the thermally-sensitive gels can be confirmed and assessed by a combination of fluorescence-marking and metabolic-producing reagents. After watching this video, you should have a good understanding of how thermally-sensitive injectables are applied in intervertebral discs, tissue engineering, and how composites may enhance certain material properties.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Bioengenharia

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

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Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

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Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

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Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

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Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

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Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...