Name: en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00
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This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

पशु काम फ़्राइबर्ग, स्विट्जरलैंड के पशु चिकित्सा कार्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल हमारी संस्था में जानवरों की देखभाल और प्रयोग पर दिशा निर्देशों के बाद। 1. पृ?...

<ol>
	<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase:+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation.">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149 (2013).</li><li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthases:+regulation+and+function.">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li><li>Yang, Z., Ming, X. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus:+role+of+NAD(P)H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li><li>Yang, Z., Ming, X. 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सं या ओ 2 की जांच .- फ्लोरोसेंट रंगों के साथ अक्सर ऊतक cryosections 23 में सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं में कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था और यह भी। यहाँ हम बरकरार रहने वाले रक्त वाहिकाओं, यानी करन?...

संवहनी endothelial कोशिकाओं vasoactive कारकों 1 रिहा द्वारा नाड़ी कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता रखने के लिए। इन कारकों के अलावा, endothelium व्युत्पन्न नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) endothelial NO-synthase (एनोस) के माध्यम से एल arginine से उत्पादित हृदय शरीर क्रिया विज्ञान 2 में सबसे महत्वपूर्ण और सबसे अच्छा विशेषता कारक है। कोई चिकनी मांसपेशी छूट का कारण बनता है और सेल प्रसार को रोकता है, subendothelial अंतरिक्ष में प्लेटलेट एकत्रीकरण और भड़काऊ कोशिका आसंजन और घुसपैठ को रोकता है, इसलिए रोग विकास 3 के खिलाफ की रक्षा। उम्र बढ़ने, उच्च रक्तचाप, मधुमेह, कोलेस्ट्रॉल, आदि सहित कई शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत, endothelial रोग की विशेषता सं जैव उपलब्धता में कमी आई है और वृद्धि की हे 2 .- उत्पादन मौजूद है और atherosclerosis 2 के रोगजनन को बढ़ावा देता है। हाल के वर्षों से अध्ययन दर्शाते हैं कि एनोस की uncoupling एक हैendothelial रोग है, जिसमें एनोस एंजाइम हे 2 उत्पन्न करता है .- NO के बजाय के लिए महत्वपूर्ण तंत्र, विभिन्न ऊपर उल्लिखित शर्तों 1,4 के तहत। इसलिए, endothelial समारोह का विश्लेषण, विशेष रूप से, कोई उत्पादन endothelial और हे 2 .- पीढ़ी हृदय रोगों और जटिलताओं पर प्रायोगिक अनुसंधान के लिए निर्णायक है। वहाँ कई methodological दृष्टिकोण है कि विश्लेषण और जैविक नमूने में कोई उत्पादन मापने के लिए विकसित किया गया है। और सं 3 - - नहीं की बेहद अस्थिर स्वभाव जो आसानी से सं 2 ऑक्सीकरण हो जाता है के कारण 3 से 6 सेकंड के एक आधा जीवन के साथ, यह सीधे मापने के लिए मुश्किल है। / नहीं 3 - - की सं 2 इसलिए दृढ़ संकल्प तरल पदार्थ के नमूने में कोशिकाओं या ऊतकों 5 से रिहा सं के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है, विधि है, तथापि, ईए/ नहीं 3 - - समाधान में निहित sily स्थिर सं 2 की उच्च पृष्ठभूमि से प्रभावित। क्योंकि कोई घुलनशील guanylate साइक्लेज चक्रीय ग्वानोसिन मोनोफास्फेट (cGMP) 6 का उत्पादन करने के लिए उत्तेजित करता है, सेलुलर cGMP स्तर पर भी कोई रिलीज 7 अनुमान लगाने के लिए निर्धारित किया गया है। फिर, यह एक अप्रत्यक्ष अनुमान है और विशिष्ट नहीं हो सकता है, क्योंकि इस तरह के सी प्रकार नैट्रियूरेटिक पेप्टाइड (सीएनपी) के रूप में कुछ endothelium व्युत्पन्न कारकों को भी कण guanylate साइक्लेज 8 के सक्रियण के माध्यम cGMP का स्तर बढ़ाने के लिए कर सकता है। सं के रूप में एक उप-उत्पाद के 9, एल citrulline उत्पादन की माप इसलिए भी कोई उत्पादन अनुमान लगाने के लिए एक अप्रत्यक्ष विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है एल citrulline की पीढ़ी के साथ एल arginine से निर्मित है। इस विधि का प्रमुख कमियां हैं कि यह रेडियोधर्मी है और यह बायोएक्टिव कोई स्तर उपाय नहीं है, के बाद से जारी हे 2 द्वारा सं तेजी से निष्क्रिय किया जा सकता है .-; इसके अलावा, एल citrulline एल को साफ किया जा सकता10 arginine। ऐसे chemiluminescence का पता लगाने के 11, इलेक्ट्रॉन स्पिन गूंज 12, या विद्युत porphyrinic कोई सेंसर के रूप में 13 अन्य रासायनिक विधियों कई जांचकर्ताओं द्वारा किया जाता है। इन विधियों आमतौर पर नहीं परिचालन में आसान है, का पता लगाने के प्रक्रियाएं हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। ऐसा नहीं है कि कई अध्ययनों के साथ या endothelium endothelial समारोह का आकलन करने और परोक्ष रूप से endothelium व्युत्पन्न कोई मध्यस्थता संवहनी छूट को मापने के लिए बिना पृथक रक्त वाहिकाओं के साथ अंग स्नान प्रयोगों लागू करने का उल्लेख भी है। हालांकि, इस पद्धति है, हालांकि यह ज्यादातर शारीरिक स्थिति के करीब है, लेकिन सख्ती से कहने के लिए, कोई समारोह उपाय नहीं है, बल्कि यह सामान्य में endothelium की मध्यस्थता vasomotor प्रतिक्रियाएं कि एनोस समारोह का शुद्ध प्रभाव प्रतिबिंबित करती हैं, के उत्पादन का आकलन अन्य endothelium व्युत्पन्न आराम कारकों और endothelium व्युत्पन्न करार कारकों, हे 2 .- के उत्पादन, और भी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएंइन कारकों के लिए। एनोस समारोह या सं उत्पादन का एक विशिष्ट विश्लेषण आमतौर पर 3 आवश्यक है। हमारा सहित कई अनुसंधान समूहों प्रतिदीप्ति डाई विधि का इस्तेमाल सं 14-19 के intracellular उत्पादन पता लगाने के लिए हाल के वर्षों में किया है। इस विधि में सेल पारगम्य प्रतिदीप्ति सूचक diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) इन विट्रो या पूर्व vivo में कोशिकाओं और ऊतकों में रहने वाले रिक्त कोई और ओपन स्कूल समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सिद्धांत है जीवित कोशिकाओं में, DAF-2DA intracellular esterase द्वारा गैर फ्लोरोसेंट 4,5-diaminofluorescein को deacetylated है कि (DAF-2) जो तब कोई साथ प्रतिक्रिया द्वारा फ्लोरोसेंट DAF-2 triazole (DAF-2T) परिवर्तित कर दिया गया । DAF-2T से प्रतिदीप्ति एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी या एक प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन 14 के तहत देखा जा सकता है। intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता इसलिए कोशिकाओं में intracellular कोई उत्पादन या बरकरार रक्त vesse में एक की endothelium को दर्शाता हैएल। ऐसे dihydroethidium (DHE) के रूप में एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति डाई के साथ संयुक्त, एक साथ कोशिकाओं में या रक्त वाहिकाओं 14 में intracellular कोई और ओ 2 .- पीढ़ी का आकलन कर सकते हैं। इसी तरह, DHE भी एक सेल पारगम्य यौगिक है कि हे 2 से ऑक्सीकरण हो जाता है .- कोशिकाओं के अंदर और ऑक्सीडेटिव उत्पाद तो न्यूक्लिक एसिड के साथ intercalates एक चमकदार लाल रंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन से मात्रात्मक detectable फेंकना है। के रूप में यह अनिवार्य रूप से सुपरऑक्साइड कण का पता लगाता है, कोशिकाओं द्वारा अच्छी तरह से बनाए रखा है, और यहां तक कि हल्के निर्धारण 20 को बर्दाश्त कर सकते हैं DHE हे 2 .- जैविक नमूनों से पता लगाने के लिए एक बहुत ही विशेष डाई है। इस प्रतिदीप्ति डाई विधि के लाभ में से एक यह है कि यह पता लगाता है और सीधे एक जीवित रक्त वाहिनियों की अक्षुण्ण endothelial परत पर कोई और / या ओ 2 .- visualizes एन चेहरा है। इस कागज़ पे,हम इस प्रतिदीप्ति डाई और कोई पता लगाने के लिए विधि हे 2 .- जो हम एन सं के चेहरे का पता लगाने और ओ 2 के लिए अनुकूलित है वर्णन .- एक मोटापा माउस मॉडल उच्च वसा आहार (HFD) दूध पिलाने से प्रेरित बरकरार aortas में। हम जानते हैं कि इस पद्धति का सफलतापूर्वक और मज़बूती से कोई और ओ 2 .- के स्तर को मापने और मोटापे में हौसले से पृथक बरकरार माउस aortas के endothelial परत में एनोस का मूल्यांकन (dys) समारोह सका प्रदर्शित करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1168</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1306</td>
			<td>dissolve with water to 300 &#181;mol/L as 1000X stock,stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vector labor. (reactolab)</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Myograph System&#160;</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>National Institute of Health(NIH)</td>
			<td>Image J&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors&#160;</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>SDC-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissors&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>JF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#215;1/2&#698; syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip round diam15mm</td>
			<td>vwr</td>
			<td>631-1579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1 mL</td>
			<td>vwr</td>
			<td>RFL-1200c&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 uL</td>
			<td>vwr&#160;</td>
			<td>613.0659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A-6625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

अन्तःस्तर व्युत्पन्न नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) endothelial NO-synthase (एनोस) से उत्पादित हृदय शरीर क्रिया विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण vasoprotective अणुओं में से एक है। बेकार एनोस ऐसे एनोस की uncoupling सं जैव उपलब्धता और सुपरऑक्साइड आयनों में वृद्धि में कमी की ओर जाता है के रूप में (ओ 2 .-) उत्पादन, और बदले में हृदय रोगों को बढ़ावा देता है। इसलिए, कोई और ओ 2 .- endothelial कोशिकाओं में स्तरों के उचित माप हृदय रोगों और जटिलताओं पर अनुसंधान के लिए निर्णायक हैं। कोई और ओ 2 .- की बेहद अस्थिर प्रकृति के कारण, यह कोई उपाय और ओ 2 .- सीधे एक रक्त वाहिका में करना मुश्किल है। कई तरीकों कोई उपाय और ओ 2 .- उत्पादन के लिए विकसित किया गया है। यह, हालांकि, तो असंवेदनशील, या गैर विशिष्ट, या तकनीकी रूप से मांग की है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। यहाँ हम एक adaption का वर्णनएन चेहरे एक साथ पता लगाने और intracellular कोई और ओ 2 के दृश्य .-, सेल पारगम्य diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) और dihydroethidium (DHE) का उपयोग कर क्रमश: एक मोटापा माउस मॉडल की बरकरार aortas प्रेरित में लिए प्रतिदीप्ति डाई विधि की उच्च वसा वाले आहार खिलाने से। हम intracellular सं मोटापा माउस के हौसले पृथक बरकरार aortas में कमी आई सका प्रदर्शन और बढ़ाया हे 2 .- के स्तर को नियंत्रित दुबला माउस की तुलना में। हम जानते हैं कि इस विधि प्रत्यक्ष पता लगाने और सं के दृश्य और ओ 2 के लिए एक आसान तकनीक .- बरकरार रक्त वाहिकाओं में है और व्यापक रूप से (फिजियो) रोग की स्थिति के तहत endothelial (dys) समारोह की जांच के लिए लागू किया जा सकता प्रदर्शित करता है।

मोटापे की वजह से इस्कीमिक कोरोनरी हृदय रोग का एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है और साथ जुड़ा हुआ है कोई bioavailability, atherosclerotic रोग 21 वर्ष की एक बानगी endothelial कमी आई है। एनोस-uncoupling उम्र बढ़ने के 22, atherosclerosis, और ...

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En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

बरकरार धमनियों की endothelial परत में नाइट्रिक ऑक्साइड और Superoxide के एन चेहरा पहचान

इस लेख में हम एक अनुकूलित अपेक्षाकृत आसान विधि प्रतिदीप्ति डाई एन चेहरे एक साथ पता लगाने और intracellular नाइट्रिक ऑक्साइड के दृश्य (सं) और सुपरऑक्साइड आयनों (ओ 2 के लिए diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) और dihydroethidium (DHE) का उपयोग का वर्णन .- ) क्रमश: हौसले में एक मोटापा माउस मॉडल की बरकरार aortas अलग।

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Research

JoVE Journal

Biology

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सिंगल mitochondrial superoxide बरकरार दिल में चमक या की confocal इमेजिंग<em&gt; में Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण में oxidative तनाव का विश्लेषण

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; एक अलग चूहा महाधमनी के रख रखाव और endothelial में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

विकास और की विशेषता<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Microvessel नेटवर्क और endothelial की मात्रात्मक मापन [सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; मैं</sub&gt; और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

मापने नाइट्राइट और नाइट्रेट, मेटाबोलाइट्स नाइट्रिक ऑक्साइड मार्ग में, जैविक सामग्री में Chemiluminescence विधि का उपयोग

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

माउस ब्लड वेसल्स का एन फेस तैयार करना

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट नाइट्रिक ऑक्साइड का आवेदन (सं •) जांच, geNOps, एकल कक्षों में सं • सिग्नल की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...