Name: en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00
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This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

lavoro Animal è stato approvato dal Comitato Etico del veterinario di Friburgo, in Svizzera. Il protocollo segue le linee guida sulla cura degli animali e la sperimentazione presso il nostro istituto. 1. Preparazione di un set-up per l&#39;incubazione di isolato arterie <ol><li> Costruire un sistema di bagno per organi che può essere riscaldato a 37 ° C e aerato con 95% O 2 e 5% CO 2 da un serbatoio di carbonio. </li><li> Preparare quanto tampone bicarbonato di Kre...

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	<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase:+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation.">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149 (2013).</li><li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthases:+regulation+and+function.">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li><li>Yang, Z., Ming, X. 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USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).</li><li>Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nitric+oxide+production+from+a+perfused+organ+by+a+luminol-H2O2+system.">Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system.</a> Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).</li><li>Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+nitric+oxide+generation+in+the+ischemic+heart+using+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Biol. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus:+role+of+NAD(P)H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li><li>Yang, Z., Ming, X. 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Rilevazione di NO o O 2 .- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni 23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O 2 .- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vasco...

Le cellule endoteliali vascolari mantenere l&#39;integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi 1. Tra questi fattori, l&#39;ossido di azoto endotelio-derivati ​​(NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare 2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l&#39;aggregazione piastrinica e l&#39;adesione delle cellule infiammatorie e l&#39;infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare 3. In molte condizioni fisiologiche e patologiche, tra cui l&#39;invecchiamento, ipertensione, diabete, iperlipidemia, ecc, disfunzione endoteliale caratterizzata da ridotta biodisponibilità di NO e aumentato O 2 .- produzione è presente e promuove la patogenesi dell&#39;aterosclerosi 2. Gli studi degli ultimi anni dimostrano che il disaccoppiamento di eNOS è unimportante meccanismo per la disfunzione endoteliale, in cui l&#39;enzima eNOS genera O 2 .- invece di NO, nelle varie condizioni suddette 1,4. Pertanto, l&#39;analisi della funzione endoteliale, in particolare, endoteliali produzione di NO e O 2 .- generazione è fondamentale per la ricerca sperimentale sulle malattie cardiovascolari e complicanze. Ci sono numerosi approcci metodologici che sono stati sviluppati per analizzare e misurare la produzione di NO in campioni biologici. A causa della natura estremamente labile di NO che viene facilmente ossidato a NO 2 - e NO 3 - con un&#39;emivita di 3 a 6 sec, è difficile da misurare direttamente NO. Pertanto determinazione di NO 2 - / NO 3 - nei campioni di liquido è stato usato come indice di NO liberato dalle cellule o tessuti 5. Anche se la procedura è relativamente semplice, il metodo è, tuttavia, easily affetto da alta sfondo di NO stabile 2 - / NO 3 - contenuto nella soluzione. Perché NO stimola solubili della guanilato ciclasi per la produzione di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) 6, il livello di cGMP cellulare è stato anche determinato a stimare il rilascio di NO 7. Anche in questo caso, si tratta di una stima indiretta e non può essere specifica, dal momento che alcuni fattori endotelio-derivati ​​come il C-peptide natriuretico di tipo (CNP) potrebbe anche aumentare i livelli di cGMP attraverso l&#39;attivazione di particolato guanilato ciclasi 8. NO è prodotto da L-arginina con generazione di L-citrullina come sottoprodotto 9, misura della produzione di L-citrullina è quindi utilizzato anche come un metodo indiretto per stimare la produzione di NO. I principali svantaggi di questo metodo sono che è radioattivo e non misura i livelli di NO bioattivi, dal momento che NO Liberatoria potrebbe essere rapidamente inattivato da O 2 .-; Inoltre, L-citrullina può essere riciclato a L-arginina 10. Altri metodi chimici come il rilevamento chemiluminescenza 11, risonanza di spin elettronico 12, o porfirinico elettrochimico NO sensore 13 sono utilizzati da molti ricercatori. Questi metodi non sono di solito facile in funzionamento, le procedure di rilevamento e richiedono attrezzature speciali. E &#39;anche ricordare che molti studi si applicano esperimenti bagno per organi con i vasi sanguigni isolati con o senza l&#39;endotelio per valutare la funzione endoteliale e indirettamente misura non mediata rilassamenti vascolare endotelio-derivati. Tuttavia, questo metodo, anche se è principalmente vicino alla situazione fisiologica, ma strettamente a dire, non misura NO funzione, piuttosto valuta endotelio-mediata risposte vasomotorie in generale che riflettono effetti netti della funzione eNOS, produzione di altri derivazione endoteliale rilassante fattori e fattori contraenti endotelio-derivati, la produzione di O 2 .-, e anche le risposte delle cellule muscolari liscea questi fattori. Un&#39;analisi specifica della funzione eNOS e la produzione di NO è di solito necessario 3. Molti gruppi di ricerca hanno compreso il nostro, negli ultimi anni ha usato il metodo colorante fluorescente per rilevare la produzione intracellulare di NO 14-19. In questo metodo è stato utilizzato il cellulare spia permeabile fluorescenza diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) per misurare la libera funzione NO e NOS in cellule e tessuti in vitro o ex vivo vivente. Il principio è che nelle cellule viventi, DAF-2DA è deacetilata da esterasi intracellulare di non fluorescente 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) che è stato poi convertito in fluorescente DAF-2 triazolo (DAF-2T) reagendo con NO . La fluorescenza da DAF-2T può essere osservata sotto un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a fluorescenza 14. L&#39;intensità della fluorescenza intracellulare riflette quindi la produzione NO intracellulare nelle cellule o dell&#39;endotelio di un intatto in vesse sanguel. In combinazione con uno specifico colorante fluorescente come dihydroethidium (DHE), si può valutare contemporaneamente intracellulare NO e O 2 .- generazione nelle cellule o nei vasi sanguigni 14. Analogamente, DHE è anche un composto cellula-permeabile che viene ossidato da O 2 .- all&#39;interno delle cellule, e il prodotto ossidativo poi intercala con acidi nucleici per emettere un colore rosso vivo rilevabile quantitativamente mediante microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale. DHE è un colorante molto specifica per il rilevamento di O 2 .- da campioni biologici, in quanto rileva essenzialmente radicali superossido, viene mantenuto bene da cellule, e può anche tollerare fissaggio lieve 20. Uno dei vantaggi di questo metodo colorante fluorescente è che rileva e visualizza NO e / o O 2 .- en face direttamente sullo strato endoteliale intatto di un vaso sanguigno vivente. In questo documento,descriviamo questo metodo colorante fluorescente per rilevare NO e O 2 .- che abbiamo adattato per en face detection di NO e O 2 .- in aorte intatte di un modello murino di obesità indotta da alto contenuto di grassi, la dieta (HFD) di alimentazione. Abbiamo dimostrato che questo metodo potrebbe con successo e in modo affidabile misurare NO e O 2 .- livelli e valutare la funzione eNOS (dis) nello strato endoteliale di appena isolate aorte intatte mouse in obesità.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1168</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1306</td>
			<td>dissolve with water to 300 &#181;mol/L as 1000X stock,stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vector labor. (reactolab)</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Myograph System&#160;</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>National Institute of Health(NIH)</td>
			<td>Image J&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors&#160;</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>SDC-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissors&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>JF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#215;1/2&#698; syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip round diam15mm</td>
			<td>vwr</td>
			<td>631-1579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1 mL</td>
			<td>vwr</td>
			<td>RFL-1200c&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 uL</td>
			<td>vwr&#160;</td>
			<td>613.0659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A-6625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O 2 .-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O 2 .- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O 2 .-, è difficile misurare NO e O 2 .- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O 2 .- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O 2 simultanea .- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l&#39;alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato 2 .- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O 2 .- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l&#39;indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.

L&#39;obesità è un importante fattore di rischio di malattia coronarica ischemica ed è associata a diminuzione endoteliale NO biodisponibilità, un segno distintivo della malattia vascolare aterosclerotica 21. eNOS-disaccoppiamento ha dimostrato di essere un importante meccanismo di disfunzione endoteliale in numerose condizioni fisiologiche e patologiche inclusi anziani 22, arteriosclerosi, l&#39;obesità e 14. Pertanto, qui mettiamo a confronto i top...

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En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

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Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...