Name: a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice at JoVE.com

The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Syst&#232;me Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).</li><li>Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+glaucoma.">Animal models of glaucoma.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).</li><li>Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+human+glaucomatous+optic+nerve+damage:+insights+from+rodent+models+of+glaucoma.">Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma.</a> Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).</li><li>Bunker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+glaucoma+induced+by+ocular+injection+of+magnetic+microspheres.">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+to+experimental+glaucoma+among+3+mouse+strains+using+bead+and+viscoelastic+injection.">Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection.</a> Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).</li><li>Cone, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia,+mouse+strain+and+age+on+intraocular+pressure+and+an+improved+murine+model+of+experimental+glaucoma.">The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma.</a> Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).</li><li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+patterns+of+dendritic+remodeling+in+early-stage+glaucoma:+evidence+from+genetically+identified+retinal+ganglion+cell+types.">Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types.</a> Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).</li><li>Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+non-invasive+proton+NMR+spectroscopy+measurement+of+vitreous+lactate+in+a+rabbit+model+of+ocular+hypertension.">Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension.</a> Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).</li><li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbead+occlusion+model:+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice.">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).</li><li>Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+experimental+glaucoma+models+in+rats:+comparison+of+the+effects+of+intraocular+pressure+elevation+on+retinal+ganglion+cell+size+and+death.">Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death.</a> Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).</li><li>Weber, A. J., Zelenak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+glaucoma+in+the+primate+induced+by+latex+microspheres.">Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres.</a> J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).</li><li>Ho, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+aqueous+humor+dynamics+upon+chronic+ocular+hypertension+and+hypotensive+drug+treatment+using+gadolinium-enhanced+MRI.">In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead-induced+ocular+hypertensive+mouse+model+for+screening+and+testing+of+aqueous+production+suppressants+for+glaucoma.">Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).</li><li>Gallego, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IOP+induces+upregulation+of+GFAP+and+MHC-II+and+microglia+reactivity+in+mice+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma.">IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma.</a> J neuroinflammation. 9, 92 (2012).</li><li>Rojas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+mouse+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma+exhibit+multiple+signs+of+activation+in+all+retinal+layers.">Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers.</a> J neuroinflammation. 11, 133 (2014).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).</li><li>Morquette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD2-mediated+inhibition+of+mTOR+promotes+dendrite+retraction+induced+by+axonal+injury.">REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury.</a> Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).</li><li>Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+neuroprotection+in+glaucoma:+role+of+galantamine-mediated+activation+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Cell Death Dis. 1, 27 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

טכניקת הווידאו המובאת כאן מספקת מפורטות צעד אחר צעד הוראות כיצד לבצע הזרקת intracameral של microbeads המגנטי ביעילות reproducibly לגרום העלאת IOP בעכברים. תוצאות הליך זה ב עלייה מתמשכת IOP שאינה דורשת זריקות נוספות ומקדם soma RGC לגילוי ואובדן האקסון בתוך 3 השבועות הראשונים של יתר לחץ דם עינית induction.Elevated IOP הוא גורם סיכון עיקרי לפיתוח גלאוקומה בבני אדם. לכן, זהו מודל גלאוקומת יתר לחץ דם תלוי עינית murine ערך כי יש פוטנציאל עבור מגוון רחב של יישומים. חסרון נפוץ הקשורות הזרקת microbeads לתוך החדר הקדמי מתייחס חרוז ריפלוקס באמצעות זריקת כשהמחט היא נסוגה, עלולה לגרום לחסימה חלקית בלבד של יצוא מהימי ולהבדלים מוגברים. כדי לטפל בבעיה זו, כמה משינויים מהותיים יושמו. firs<html> t, ההכנה הקפדנית של microneedle זכוכית נקיה, חד עם שפוע facetted חיוני הזריקה המוצלחת של microbeads. Microneedle הוכן כראוי מאפשר חדירה מבוקרת וחלקה של הקרנית עם יישום מינימאלי של לחץ על פני השטח של עין העדינה. לנקב קרנית הקטנה מונע זרימה חוזרת של microbeads. בנוסף, microneedle המיקרוסקופי מפחית את הסיכון של מבנים סמוכים תהליכים מזיקים כגון קשתית ואת העדשה, אשר עלול לגרום דלקת שאינה קשור למחלה. שנית, הבקשה של מגנט כף יד לאזורים עיניים אסטראטגי במהלך ואחרי ההזרקה עוד היבט קריטי של הטכניקה הזו. במהלך ההזרקה, המגנט משמש כדי למשוך את microbeads המגנטי ריפלוקס מניעת הלשכה הקדמי של microbeads כאשר microneedle היא נסוגה. לאחר הזריקה, המגנט מכן נעשה שימוש כדי לכוון את microbeads לזווית iridocorneal לחסום יצוא הומור מימי. אוהל &quot;&gt; בעיה נוספת נתקל לעתים קרובות במודלים חסימה microbead הוא כי זריקות חרוז חוזרות לעתים קרובות יש צורך להשיג מתמשכת IOP העלאת 10,11. זו עשויה להיות התוצאה של microbeads dislodging מהזווית iridocorneal עם הזמן. השילוב של מגנט כף יד, כמתואר לעיל, ואת המיקום של העכבר שלאחר ניתוח משפר באופן משמעותי את התוצאה. שימוש הרדמה בזריקות, המאפשרים גמיש כדי להזיז את הראש במהלך ההליך ודורש תקופת החלמה שלאחר ניתוח ארוך יותר, הוא מועדף. מיקום של עכבר בעין המופעלת כלפי מעלה במשך כמה שעות לאחר הניתוח תורם ליישוב microbeads בזווית iridocorneal ומפחית את הסיכון של פירוק בחזרה לתוך החדר הקדמי. הבטחה כי מספר החרוזים המוזרקים הוא יחסית עקבי היא עוד שלב קריטי כדי למזער וריאציות בין-חיה. מאז microbeads להתיישב בבית בottom של הצינור, יש צורך homogenize פתרון microbead המלא ולסגת הנפח המתאים לתוך microneedle מבעוד מועד. הזרקה של חרוזים פחות לתוך החדר הקדמי עלולה לגרום לחסימה החלקית של מבני ניקוז הומור המימיים, אשר צפוי לגרום העלאת IOP עניה או משתנית. מן הראוי לציין כי, למרות המטרה הסופית של הזרקת microbead היא לרומם IOP, יש לנקוט זהירות כאשר מדידות לחץ תוך עיני מעכברים ער גבוהים יותר מאשר ערכי השיא שדווח במחקר זה (~ 25 מ&quot;מ כספית). IOPS גבוהה מאוד להגדיל את הסיכון לנזק איסכמי עלולים גם הם לגרום כאב לחיה. את העלאתו של IOP צריכה להיחשב כאחד גורמים רבים להעריך את ההצלחה של הניתוח. ככזה, התוצאה של ההליך צריך תעיד מבוסס על מספר פרמטרים ובכלל זה העלאת IOP, מוות soma RGC, ואובדן האקסון. אף על פי הפרוטוקול המתואר כאן תוצאות ברוב microbeads מוצלחly ליישוב בזווית, מגבלת פוטנציאל של מודל זה היא כי חרוזים אלה שנותרו צף החדר הקדמי עלולים להפריע הדמית רשתית חייה דרך הקרנית, כמו גם מבחני אלקטרו או התנהגותיים הדורשים מעבר של אור יעיל. היבט חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון בעת ​​ניצול מודל חסימה microbead זו היא כי מידת הגובה IOP וניוון RGC עוקבות משתנה עם גיל ורקע הגנטי של העכבר פעל [4]. לכן, במידה של העלאת IOP ואת ציר הזמן של ניוון RGC יהיה צורך שנקבע לכל קו עכבר מהונדס ספציפיים ו / או טווח הגילאים. אחד מאפיינים של מודל זה הוא שתוצאות IOP גבוהות לאובדן ההדרגתי של מות RGC במהלך שלושת השבועות הראשונים לאחר הזרקת microbead, ומות RGC משמעותי מזוהות ב 3 שבועות לאחר ההליך. לפיכך, מודל זה מאפשר בחינת שינויים מוקדמים ו / או עדינים המתרחשים ד זהisease, לפני גלויים soma RGC ואובדן האקסון. עלייה משמעותית למות RGC לא נצפתה בין 3 ו -6 שבועות לאחר הגיוס של יתר לחץ דם עיניים. למעשה, אובדן סומה האקסון RGC נותר יציב ברמה של ~ 22 - 25% בין 3 ל -6 שבועות למרות מוצלח ומתמשך העלאת IOP בנקודות זמן אלה. משכו זמן ארוך יותר של IOP המתמשכת עשוי להידרש אובדן RGC נוסף להתרחש C57BL / 6 עכברים, שכפי הנראה להיות עמיד יותר בפני ניזקי RGC לעומת זני עכבר אחרים. 5 שינויים נוספים הפרוטוקול המובא כאן, לרבות התאמת גודל חרוז וזריקות נוספות, ייתכן שתידרש כדי ללמוד אובדן RGC בנקודות מאוחר יותר זמן. לכן, הפרוטוקול שלנו הוא אידיאלי עבור מחקרים התמקדו בשינויי pathophysiological מוקדם מתואמים עם ניוון מוחיה צנוע RGC אשר רלוונטיים התפרצות והתקדמות מוקדם גלאוקומת אדם.

גלאוקומה היא מחלה מסנוורת מתקדמת ובלתי הפיכה שתשפיע כ -80 מיליון אנשים ברחבי עולם עד שנת 2020 1. בחולי גלאוקומה, אובדן ראייה נגרם על ידי מותו סלקטיבית של תאי הגנגליון ברשתית (RGCs), הנוירונים פלט המעבירים מידע חזותי מן מהרשתית אל המוח. גלאוקומה היא מחלה ניוונית של מערכת עצבים הקשורות לגיל עם גורמי סיכון רבים אשר הנפוץ ביותר היא לחץ תוך עיני מוגבר (IOP). ואכן, IOP הוא גורם הסיכון הניתנים לשינוי רק גלאוקומה טיפולים שוטפים להתמקד אך ורק בניהול הלחץ בעין. עם זאת, גורמים גנטיים, הסלולר, וסביבתיים מרובים המשפיעים על ההופעה והתקדמות של המחלה הזאת. לכן, הבנת המנגנונים השונים שבסופו של דבר לתרום ומוות עצבי חיוני לפתח טיפולים יעילים גלאוקומה. במודלים של בעלי חיים של גלאוקומה חיוניים ללמוד פתופיזיולוגיה מחלות לזהות ולבדוקרפוי הבטיח. הזמינות הגוברת של קווי עכבר מהונדס כולל זנים בנוקאאוט מותנה עכברים שנשאו קליעים נותבים ניאון גנטית בקידוד הזניקה את הצורך מודלים גלאוקומה murine מושרה. במודלים של מכרסמים כמה גלאוקומה פותחו לאורך השנים (הנסקרת ב 2,3). ברבים מן המודלים האלה, גלאוקומה מושרה ע&quot;י שיבוש דינמיקת הומור מימי, וכתוצאה מכך העלאת IOP. מודלים ספיגים, שבו microbeads או חומרים אחרים מוזרקים לתוך החדר הקדמי של העין לחסום ניקוז מימי, צברו פופולריות בשנים האחרונות בין היתר בשל הקלות היחסית שלהם להגדיל IOP 4-14. מודל חסימת microbead של גלאוקומה, בצע לראשונה פרימטים 12, ארנבות 8, וחולדות 4,9,11, הותאם לאחרונה לשימוש בעכברים 5,6,10. במחקרים אלה, זריקת intracameral של microbeads פוליסטירן, לבד אובשילוב עם חומר viscoelastic, הביא העלאת IOP מוביל 6,10 למות RGC שלאחר מכן. עם זאת, ריפלוקס כשהמחט היא נסוגה מן העין ומן הפירוק של microbeads מזווית iridocorneal הן בעיות נפוצות המתעוררות במהלך ההליך. כדי למזער את החסרונות האלה, מגנטים שימשו כדי למשוך את microbeads מגנטי לזווית iridocorneal של העין 4,9. הפרוטוקול המתואר כאן הוא הליך שונה בהתבסס על מחקרים קודמים 9,10 המשתמש microbeads מגנטי מגנט כף יד מותאמי עין העכבר (איור 1). כמה משינויים מהותיים הוכנסו בפרוטוקול שלנו על מנת להבטיח עליית IOP יעילה לשחזור בעכברים. ראשית, הזרקה של microbeads נעשה באמצעות microneedle זכוכית שהוכן בקפידה עם שפוע facetted. משטחי החלקים וכתוצאה מכך של microneedle וכן הקצה המחודד שלה מבטיח כי ניזק מינימאלי הואשנגרם כפי שהוא מנפץ את הקרנית. השימוש microneedle זכוכית פעולה זו גורמת גם שליטה מוגברת כאשר קצה microneedle נכנס לתא הקדמי, ובכך להפחית את הסיכון של מבנים סמוכים תהליכים מזיקים כגון הקשתית ואת העדשה. בנוסף, נגע ההזרקה הזעיר הופך לפשוט תיקון עצמי קרני ומפחית תופעות הקשורות פגיעה בלתי רצויות. שנית, ההזרקה של microbeads המגנטי ושימוש מגנט כף יד מאפשרים שליטה מדויקת כדי למשוך את החרוזים לזווית iridocorneal בעיני העכבר הקטנות. microbeads מגנטי כי הם 4.5 מיקרומטר בקוטר היו בשימוש בגלל גודל microbead זה לא לסתום את פתח microneedle המוכן חשוב, פעם מוזרקת, microbeads אלה ביעילות חסם את ניקוז הומור מימי. גישה זו לא רק מפחיתה ריפלוקס של microbeads המוזרק, אלא גם מבטיחה כי מספר מרבי של microbeads מצטבר באזור היעד לחסום ניקוז הומור מימי ביעילות. Furthermore, אסטרטגיה זו גם מפחיתה את מספר החרוזים צפים בלשכה הקדמית הימנעות ממגע עם מבנים אחרים, כמו אירוס ואת העדשה, ומעבר מניעה לתא האחורי. ביחד, שינויים אלה להבטיח כי ניתוח הזרקת microbead מתבצע בקלות יחסית במועד וכתוצאה מכך אינדוקציה לשחזור, יעילה מאוד, ומתמשכת של יתר לחץ דם עינית בעכברים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>MZ9.5</td>
			<td>Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Footswitch</td>
			<td>Linemaster</td>
			<td>T-91-SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Beveler</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Duster</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-450 Epoxy</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14011</td>
			<td>Magnetic beads are 4.5 &#181;m in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Tube Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Handheld Magnets</td>
			<td>Geomag</td>
			<td></td>
			<td>0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Containment Hood</td>
			<td>Biostad</td>
			<td>377355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (BSS)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0065-0800-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-100 Insulin Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>CS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-673-52</td>
			<td>8 x 8 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent swabs</td>
			<td>Kettenbach</td>
			<td>30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic forcep</td>
			<td>Euroband</td>
			<td>1001</td>
			<td>Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroquinolone ophthalmic solution</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td>Vigamox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>E12107-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tonometer</td>
			<td>iCare</td>
			<td>TV02</td>
			<td>TONOLAB rebound tonometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, Para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T353-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate, tryhydrate</td>
			<td>Canemco and Marivec</td>
			<td>124-65-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brn-3a antibody (C-20)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-31984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate, 48 well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow fade Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S36936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 2% aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3294949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embed-812</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadic methyl anhydride</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>110205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold-Dykstra</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porter-Blum ultra-microtome</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>MT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O (Certified Biological Stain)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>T161-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice

השימוש במודלים של מכרסמים של גלאוקומה כבר חיוני כדי להבין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות multifactorial זה. עם כניסתו של קווי עכבר מהונדסים רבים, יש עניין גובר במודלי Murine מושרים של יתר לחץ דם עיניים. כאן, אנו מציגים מודל חסימה של גלאוקומה מבוסס על הזרקה של microbeads המגנטי לתוך החדר הקדמי של העין באמצעות microneedle שונה עם שיפוע facetted. Microbeads המגנטי נמשך לזווית iridocorneal באמצעות מגנט כף יד כדי לחסום את ניקוז הומור מימי מן החדר הקדמי. הפרעה זו בתוצאות דינמיקה מימיות בתוך התעלות מתמדת של לחץ תוך עיניים, אשר לאחר מכן מוביל לאובדן של תאי גנגליון רשתית, כפי שנצפה בחולי גלאוקומת אדם. מודל חסימת microbead שהוצג בכתב היד הזה הוא פשוט בהשוואה לדגמים מושרים אחרים של גלאוקומה גם מאודיעיל לשחזור. חשוב לציין, השינויים המוצגים כאן למזער בעיות נפוצות לעתים קרובות עולות במודלי חסימה. ראשית, השימוש microneedle מזכוכית משופעת מונע זרימה חוזרת של microbeads ומבטיח כי נזק מינימלי מתרחשת לקרנית במהלך ההזרקה, ובכך להקטין תופעות הקשורות לפציעה. שנית, השימוש של microbeads המגנטי מבטיח את היכולת למשוך החרוזים ביותר לזווית iridocorneal, ובכך מפחית ביעילות את מספר החרוזים צפים בלשכה הקדמית הימנעות ממגע עם מבנים אחרים (למשל., איריס, עדשה). לבסוף, שימוש מגנט כף יד מאפשר גמישות בעת טיפול בעין העכבר הקטנה לכוון את microbeads המגנטי ביעילות להבטיח שיש ריפלוקס הקטן של microbeads מהעין כאשר microneedle היא נסוגה. לסיכום, מודל עכבר חסימת microbead המוצג כאן הוא כלי מחקר רב עצמה כדי לחקור שינויים ניווניות המתרחשים במהלך ההתפרצות וההתקדמות של גלאותִרדֶמֶת.

ההזרקה של microbeads המגנטי לתוך החדר הקדמי של עכברים בוגרים המתואר בפרוטוקול זה הביאה העלאה חזקה לשחזור של IOP. שבוע לאחר ההליך, IOP עלה מ 10 ± 0.6 מ&quot;מ הכספי (ממוצע ± SEM), את IOP הבסיס הממוצע בעיניים נגדיות, עד 19 ± 0.5 מ&quot;מ כספית בעיני יתר לחץ דם (t של הסטודנט -test; *** p &lt;0.001, n = 12, טבלה 1, איור 2). IOP התייצב ואילך ונשאר גבוה בקצב ממוצע של 20 מ&quot;מ כספית במשך לפחות 6 שבועות, בחנו זמן הנקודות הארוכות במחקר זה. IOP השיא הממוצע בעיניים מוזרקות microbead ב 2, 3, ו -6 שבועות לאחר הניתוח היה 25 מ&quot;מ כספי. הרוב המכריע של עכברים שטופלו שפותח IOP הגבוה מתמשך, ולכן פרוטוקול זה אינו מחייב זריקה שנייה של microbeads. כדי להעריך את מהלך הזמן של אובדן RGC במודל זה, סומה RGC היוראשון לכמת ידי immunostaining עם Brn3a, סמן ספציפי RGC 17. מספר התאים Brn3a החיובי היה לכמת על רשתיות שטוחות רכוב על 1, 2, 3 ו -6 שבועות לאחר הגיוס של יתר לחץ דם עיניים. למרות העלאת IOP משמעותית זוהתה מוקדם ככל 1 שבוע לאחר הזרקת microbead, ללא אובדן משמעותי של סומה RGC נצפה בתוך 2 השבועות הראשונים של ההליך (איור 3). RGC מוות משמעותי (22%), לעומת זאת, בא לידי ביטוי גם 3 שבועות (2,430 ± 67 RGCs / מ&quot;מ 2, ממוצע ± SEM, n = 12) ו -6 שבועות (2,350 ± 74 RGCs / מ&quot;מ 2, n = 10) פוסט אינדוקציה של יתר לחץ דם עינית, לעומת עיניים מלאות שלמים מעכברי un מופעל (3,141 ± 49 RGCs / מ&quot;מ 2, n = 23) (ANOVA, p &lt;0.001). חוסר תפקוד וניוון של אקסונים RGC הוא תכונת קרדינל של גלאוקומה. לכן, אובדן axonal נבדק ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead ידיכימות של אקסונים RGC בחיתוכי עצב ראייה מוכתמים toluidine הכחול (איור 4). הפסד משמעותי של אקסונים RGC (25%) נצפתה ב 3 שבועות (28,401 ± 702 אקסונים / עצב, ממוצע ± SEM, n = 5) ו -6 שבועות (29,426 ± 948 אקסונים / עצב, n = 6) לאחר ההזרקה של microbeads לעומת עצבים שלא ניזוקו אופטיים מעיני מופעלי האו&quot;ם (39,467 ± 137 אקסונים / עצב, n = 4) (ANOVA, p &lt;0.001). ביחד, נתונים אלו מראים כי הזרקה של microbeads המגנטי לתוך תא עכבר הקדמי מוביל לשחזור מתמשך גובה IOP שתוצאתו soma RGC וניוון האקסון. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> זמן לאחר ניתוח OHT </td><td> N </td><td colspan="3"> לחץ תוך עיני ממוצע (מ&quot;מ כספית) ± SEM </td><td colspan="2"> שיא IOP (מ&quot;מ כספית) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נגדי </td><td> בַּרקִית </td><td> difference </td><td> נגדי </td><td> בַּרקִית </td></tr><tr><td colspan="2"> שבוע 1 </td><td> 12 </td><td> 10 ± 0.4 </td><td> 19 ± 0.5 </td><td> 9 ± 0.6 </td><td> 12 ± 0.4 </td><td> 22 ± 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 שבועות </td><td> 13 </td><td> 11 ± 0.5 </td><td> 20 ± 0.8 </td><td> 9 ± 0.5 </td><td> 12 ± 0.9 </td><td> 25 ± 0.7 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 שבועות </td><td> 10 </td><td> 11 ± 0.8 </td><td> 20 ± 0.7 </td><td> 10 ± 0.9 </td><td> 13 ± 0.2 </td><td> 25 ± 0.9 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 שבועות </td><td> 12 </td><td> 12 ± 0.5 </td><td> 20 ± 0.6 </td><td> 9 ± 0.7 </td><td> 13 ± 0.5 </td><td> 24 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> העלאת טבלה 1. הלחץ התוך עיני בבית Occlusi Microbead מגנטי Murineעל דגם. בשנת נקבה ערה C57 BL / 6 עכברים, IOP נמדדו באמצעות tonometer ריבאונד מכויל. עיניים מופעלות מוצגות עלייה בלחץ תוך עיניים זוהתה שלאחר ניתוח שבוע שנותרה גבוה במשך שישה שבועות לפחות לאחר ההליך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" /> באיור 1. Workflow של השלבים הכרוכים במודל של גלאוקומה ספיגה Microbead מגנטי Murine. צעד אחר צעד המתאר של כל ההליכים שבוצעו לפני, במהלך, ואחרי הניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" /> הגדל איור 2. לחץ תוך עיני במודל ספיגה Microbead מגנטי Murine. ב ערC57 BL / 6 נקבות עכברים, IOP נמדדה באמצעות tonometer ריבאונד מכויל. IOPS עיניים מוזרק microbead היה גבוה משמעותי שלאחר ניתוח שבוע (ANOVA, p &lt;0.001). IOPS נותר גבוה יחסית משמעותי לעין הנגדית של עכברים שהוזרקו במשך לפחות 6 שבועות (ANOVA, p &lt;0.001). (שלמים: n = 12; 1 בשבוע: n = 12, 2 שבועות: n = 13, 3 שבועות: n = 10, 6 שבועות: n = 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" /> איור 3. רשתית גנגליון תא מות הדגם הספיג Microbead מגנט Murine. RGCs היה דמיין ידי immunostaining של רשתית שטוחה רכוב באמצעות Brn3a רשתיות שליטות ללא פגע (א) רשתיות גלאוקומה קשות ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead להשרותיתר לחץ דם עינית (OHT) (B, C). ברי סולם: 20 מיקרומטר. (ד) ניתוח כמותי אישר כי הזרקת microbead הביא לאובדן soma משמעותי RGC ב 3 ו 6 שבועות לאחר ההליך לעומת שליטה העיניים. הצפיפות של סומה RGC פנימה בשלמותו, הלא גלאוקומת C57 / עכברי BL6 מוצגת כנקודת התייחסות (פסים לבנים, 100% הישרדות). ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM (Intact: n = 23; 1 בשבוע: n = 6, 2 שבועות: n = 6, 3 שבועות: n = 12, 6 שבועות: n = 10, ANOVA, *** p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" /> איור 4. אקסונלית ניוון במודל ספיגה Microbead מגנטי Murine. אקסונים RGC היו דמיינו ידי מכתים של חתכים עצב הראייה עם toluidine כחול בשליטה ללא פגע (א) רשתיות גלאוקומה קשות ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead לגרום ליתר לחץ דם עינית (OHT) (B, C). ברי סולם: 10 מיקרומטר. (ד) ניתוח כמותי אישר כי הזרקת microbead הביא לאובדן האקסון RGC משמעותי בשבועות 3 ו -6 לאחר ההליך לעומת שליטה העיניים. הצפיפות של אקסונים RGC פנימה בשלמותו, הלא גלאוקומת C57 / עכברי BL6 מוצגת כנקודת התייחסות (פסים לבנים, 100% הישרדות). ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM (Intact: n = 4; 3 שבועות: n = 5, 6 שבועות: n = 6, ANOVA, *** p &lt;0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice at JoVE.com

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

לחסימה Microbead מגנטי דגם כדי לגרום Ocular Hypertension-Dependent גלאוקומה עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרום ליתר לחץ דם עינית בעין murine שתוצאתו אובדן תאי הגנגליון ברשתית כפי שנצפה גלאוקומה. microbeads המגנטי מוזרק לתוך החדר הקדמי ומשך לזווית iridocorneal שימוש במגנט כדי לחסום את היצוא של הומור מימי.

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

דוגמנות שבץ בעכברים - העורקים התיכון ספיגה מוחין עם דגם נימה

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

לחץ אוורור מבוקר כדי לגרום פגיעה ריאות חריפה על עכברים

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

השימוש במערכת משקל תליה על חסימת העורקים הכליליים של עכברים

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal העורקים התיכון מוחין ספיגה (MCAO) מודל שבץ איסכמי עם הדרכה דופלר Flowmetry לייזר עכברים

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

CYP2D6 מודל החיה: כיצד לגרום דלקת כבד אוטואימונית עכברים

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...