Name: immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00
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この作品は、NIHの助成金GM68418によってサポートされていました。

1.細胞培養およびトランスフェクション<ol><li> 6ウェルのポリスチレンプレートにカバーガラス（22ミリメートル×22 mm）を入れてください。以下の手順でカバーガラス上の有糸分裂細胞を維持するための水に任意でコートポリ-L-リジンとカバーガラス、w / vの0.1％、（マテリアル/機器のリストを参照してください）​​： 注：最適な条件は、各細胞株および適用のために決定されなけれ...

近年では多くの研究が固定された細胞のための異なる定量的な顕微鏡アッセイを開発した。42セントロメア動原体の生物学の進歩は、多くの場合、細胞内の空間的・時間的規制はの変更機能を反映するのタンパク質のセントロメア特異的または動原体特異的な機能を理解する必要があります細胞周期の間に、これらのタンパク質。そこで、ここではIIF染色、具体的に異なって処理され...

「セントロメア」は、古典的遺伝学の抑制減数分裂期組換えの領域として定義され、それ以降の有糸分裂の間に正確な染色体の分離において重要な役割を果たしている有糸分裂染色体の一次狭窄、として認識されました。 「動原体」は、電子顕微鏡によって明らかにされるように、動原体の表面に微小管に結合した多層構造として説明しました。 「動原体」は、後に、有糸分裂の染色体のセントロメアに局在高分子複合体として定義されていました。脊椎動物の中で動原体DNA配列の劇的な相違にもかかわらず、動原体の構造および組成は、高度に保存されています。スピンドル微小管と動原体の間の動的相互作用は、忠実な有糸分裂時の染色体の分離、および異数性およびそれによって癌にセン​​トロメア動原体機能のリードの欠陥のために必要とされます。 ほとんどの真核生物におけるセントロメア何も定義されたDNA配列を持っていませんが、171-bpのαサテライトDNAからなる反復アルフォイドDNAの大規模な配列（0.3-5 MB）で構成されています。出芽酵母を除いて、セントロメアのアイデンティティはないDNA配列ではなく、ヒストンH3バリアントCenH3（ヒトにおけるセントロメアプロテインA [CENP-A]）を含む特別なヌクレオソームの存在によって達成される。5 CENP-Aヌクレオソームがに局在します171-bpのαサテライトDNAに対する哺乳動物動原体7と結合するのインナープレート。アクティブ動原体は、一緒に紡錘体チェックポイントを介して紡錘体とそれに続く周期の進行に染色体の付着を調節する構成的セントロメア関連するネットワーク（CCAN）の動員および動原体タンパク質を、指示するためにCENP-Aを含むヌクレオソームが必要です。 上記の証拠に照らして、CENP-Aはセントロメア8のエピジェネティックなマークであることが提案されています。しかしながら、CENP-Aが組み込まれたプロセスは、私NtoのセントロメアDNAと、この取り込みを担当する要因はまだ十分に特徴付けられていません。ショートセントロメア標的化ドメイン（CATD）は、CENP-Aの領域に折り畳むヒストンに常駐し、CATDとH3の対応する領域の交換が動原体への直接H3に十分なものである。9いくつかの研究は、翻訳後のための機能的役割を示唆しましたCENP-12-16の変更（PTM）。しかし、動原体への動員においてCENP-AのこれらのPTMの分子メカニズムはまだ解明されていません。我々は以前CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性が動原体にCENP-AのCENP-A K124のユビキチン化およびローカライズのために必要とされていることを報告した。17 動原体タンパク質の発見および特徴付けは、染色体分離に関する新たな知見をもたらしている。18 100以上の動原体の構成要素は様々なアプローチによって、脊椎動物細胞で同定されている。19,20の下で動原体が集合し、機能はまた、細胞内の各セントロメア-動原体タンパク質の細胞機能の特性評価およびタンパク質間ネットワークから来ている。19直接可視化し、蛍光顕微鏡での高度な画像処理方法が動原体動原体の構成要素の著しい分解能を提供し、許可する方法のスタンディングセントロメアと動原体の特定の分子成分の直接観察。また、特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）染色は、これらの観​​測に不可欠です。しかし、IIFプロトコルに関する多くの報告にもかかわらず、特定のセントロメア-動原体タンパク質の詳細な問題に議論少数。1-4はこのように、開発と特異的に各セントロメア動原体タンパク質を分析するIIF染色および定量IIFアッセイの方法を報告することは非常に重要です。 IIF染色では、一つの目的のタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきですかセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし、21および固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。したがって、異なる固定液法が動原体動原体タンパク質のIIF染色で重要です。 間接免疫蛍光（IIF）染色およびCENP-AおよびFLAGタグ外因性のCENP-A蛋白質、およびヒト細胞におけるこれらのタンパク質の定量を含む内因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化に対処するためのアッセイのここで最適化された方法が開発されています。これらの方法は、他の種におけるセントロメア、動原体タンパク質の分析に適用することができます。

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

内因性のCENP-Aの免疫蛍光分析は、CUL4A-E3リガーゼは、セントロメアにCENP-Aの局在に必要とされるという仮説を支持します 我々の最近の研究では、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性がCENP-Aおよび動原体へのCENP-Aの局在化に対するリジン124（K124）のユビキチン化のために必要とされることを示した。17最初に、相間-動原体複合体（ICENが）によって単?...

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Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;腎臓で

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対する順次免疫蛍光と免疫組織化学

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...