Name: immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00
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이 작품은 NIH 부여 GM68418에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> 6 웰 폴리스티렌 플레이트 커버 유리 (22mm X 22mm)를 넣습니다. 선택적으로 코트 아래 단계에 따라 커버 유리에 유사 분열 세포를 유지하기 위해 (자재 / 장비의 목록 참조) 물에 폴리 - L - 라이신과 커버 유리, V / w 0.1 %, : 주 : 최적의 조건은 각각의 세포주 및 애플리케이션에 대해 결정되어야한다. <ol><li> 물에 폴리 - L - 라이신, V / w 0.1 %와 무균 코트 문화 표면 (0.4 ㎖...

최근 몇 년 동안 많은 연구가 고정 된 세포에 대해 서로 다른 양적 현미경 분석법을 개발 하였다. (42) 진행을 센트로 - 동원체 생물학에 자주 세포 내 공간 - 시간 규제의 변화하는 기능을 반영하고있는 단백질의 센트로 별 또는 동원체 특정 기능에 대한 이해가 필요 세포주기 중에 이러한 단백질. 따라서, 우리가 IIF 염색 구체적으로 다르​​게 취급 샘플에 적용 할 수있는 내인성 및 외인?...

&quot;중심절은&quot;고전적인 유전학 억제 감수 재조합의 영역으로 정의하고 나중에 유사 분열시 정확한 염색체 분리에 필수적인 역할을한다 유사 분열 염색체의 주요 수축으로 인식되었다. &quot;Kinetochores&quot;은 전자 현미경에 의해 계시 된, 중심절의 표면에 미세 소관 결합 다층 구조로서 기술 하였다; &quot;kinetochores은&quot;나중에 유사 분열 염색체의 동원체에 지역화 거대 분자 복합체로 정의 하였다. 척추 사이 센트로 DNA 서열의 극적인 차이에도 불구하고, 구조 및 동원체 조성물은 고도로 보존된다. 스핀들 미세 소관과 동원체 사이의 역동적 인 상호 작용은 유사 분열시 염색체의 충실한 분리에 필요한 및 센트로 - 동원체 기능 리드의 결함 이수성하여 암이다. 대부분의 진핵 생물의 센트로어떠한 정의 된 DNA 서열이 없지만 171 bp의 α 위성 DNA로 이루어진 반복 alphoid DNA의 큰 배열 (0.3-5 MB)로 구성된다. 효모 신진 제외 센트로 ID가없는 DNA 서열이 아니라 히스톤 H3 변이체 CenH3 포함 특수 뉴 클레오 좀의 존재에 의해 달성된다 (센트로 단백질을 [CENP-A] 인간). 5 CENP-A의 뉴 클레오는에 지역화 171-bp의 α-위성 DNA에 포유류 kinetochores 7 바인드의 내부 플레이트. 활성 중심절이 필요 CENP-A 함유 함께 스핀들 체크 포인트를 통해 유사 분열 스핀들 및 후속주기 진행에 염색체의 부착을 조절하는 구성 적 센트로 관련 네트워크 (CCAN)과 동원체 단백질의 모집을 지시하는 뉴 클레오합니다. 상기 증거 비추어 CENP-A는 센트로 8 후성 마크 것으로 제안되었다; 그러나, 처리되는 CENP-A는 I을 인용NTO 센트로이 DNA 결합을 담당하는 요소가 아직 특징 화되지 않았다. 짧은 센트로 타겟팅 도메인 (CATD)는 CENP-A의 영역을 배 히스톤에 상주하고 CATD와 H3의 해당 영역의 교체가 센트로에 직접 H3에 충분하다. 9 몇몇 연구는 번역 후를위한 기능적 역할을 제안 수정 CENP-A 12-16의 (PTM) 그러나, 중심절에 모집에서 CENP-A의 이러한 PTMS의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 동원체에 CENP-A의 CENP-A K124의 ubiquitylation 및 지역화를 위해 필요하다고보고했다. (17) 동원체 단백질의 발견 및 특성화 염색체 분리에 관한 새로운 통찰력을 주도하고있다. 18 개의 100보다 동원체 성분을 다양한 방법으로 척추 동물 세포에서 확인되었다. (19, 20) 아래형광 현미경에 kinetochores는 조립과 기능 또한 세포 내의 각 센트로 - 동원체 단백질과 단백질 - 단백질 네트워크의 세포 기능의 특성에서 오는 방법의 서. (19) 직접 시각화 및 고급 이미징 방법은 센트로 - 동원체 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공 할 수 중심절과 kinetochores의 특정 분자 구성 요소의 직접 관찰. 또한, 특이 적 항체를 이용하여 간접 면역 형광 방법 (IIF) 염색이 관찰에 중요하다. 그러나, 특정 센트로 - 동원체 단백질의 세부 문제를 논의 IIF 프로토콜, 몇 가지에 대한 수많은 보고서에도 불구하고. 1-4 따라서, 개발하고 특히 각 센트로 - 동원체 단백질을 분석하는 IIF 염색 및 정량 IIF 분석의 방법을보고하는 것은 매우 중요합니다. IIF 염색에서, 하나의 관심 단백질의 손실을 방지하기 위해 염색 프로토콜을 진행해야하거나셀의 나머지. 그러나 고정 가끔 항원 사이트를 파괴하고, 다른 항체 - 항원 조합은 하나의 정착과 함께 제대로 작동하지만 아주 잘 다른, 21, 정착액의 선택에 크게 관심의 단백질 (들)에 따라 달라집니다. 따라서, 다른 정착 방법은 센트로 - 동원체 단백질의 IIF 염색에서 중요하다. 간접 면역 형광 (IIF) 염색 및 CENP-A와 국기 태그가 외생 CENP-A 단백질, 인간 세포에서이 단백질의 정량을 포함하여 내인성 센트로 - 동원체 단백질의 현지화를 해결하기 위해 분석의 여기에 최적화 된 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 다른 종 센트로-동원체 단백질의 분석에 적용될 수있다.

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

내생 CENP-A의 면역 형광 분석 CUL4A-E3 리가 아제가 동원체에 CENP-A의 현지화에 필요한 가설을 지원합니다 우리의 최근의 연구는 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 CENP-A와 동원체에 CENP-A의 현지화에 라이신 124 (K124)의 ubiquitylation 필요하다는 것을 보여 주었다. (17) 처음에는 계면-센트로 단지 (ICEN가)에 의해 분리 하였다 안티 CENP-A : 기본 염색질 면역, 3...

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Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...