Name: immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend GM68418.

1. Cell Culture og Transfeksjon <ol><li> Sette et dekkglass (22 mm x 22 mm) i en 6-brønns polystyren plate. Eventuelt frakk et dekkglass med Poly-L-lysin, 0,1% vekt / volum, i vann (se liste over materialer / utstyr) for å holde mitotiske celler på dekkglass å følge trinnene nedenfor: Merk: Optimale betingelser må bestemmes for hver cellelinje og anvendelse. <ol><li> Aseptisk belegge kulturoverflaten med poly-L-lysin, 0,1% vekt / volum, i vann (0,4 ml / brønn av en 6-brønns polystyren plate). Rist for ?...

I de senere år har mange studier har utviklet ulike kvantitative mikroskopi-analyser for fikserte celler. 42 Progress in cent-kinetochore biologi krever ofte en forståelse av den centspesifikk eller kinetochore-spesifikk funksjon av proteiner som subcellulære romlig-temporale regulering reflekterer de endrede funksjoner av disse proteinene i løpet av cellesyklusen. Derfor, her vi utviklet metoder for IIF farging og en kvantitativ IIF-analyse for spesifikt å analysere de relative nivåer av endogene og ek...

&quot;sentromerer&quot; ble klassisk definert som områder av undertrykt meiotisk rekombinasjon i genetikk og senere anerkjent som den primære innsnevring av mitotiske kromosomer, som spiller en viktig rolle i nøyaktig kromosom segregering under mitose. &quot;kinetochores&quot; ble beskrevet som den multilagsstrukturer som binder seg til mikrotubuli ved overflaten av sentromerer, som vist ved elektronmikroskopi; &quot;kinetochores&quot; ble senere definert som macromolecular kompleks som lokaliserer på cent av mitotiske kromosomer. Til tross for en dramatisk divergens av centromeric DNA-sekvenser blant virveldyr, kinetochore struktur og sammensetning er sterkt konservert. En dynamisk samspill mellom spindel mikrotubuli og kinetochore er nødvendig for trofast segregering av kromosomer under mitose, og defekter i cent-kinetochore funksjon fører til Aneuploidy og dermed kreft. Cent i de fleste eukaryoterhar ingen definert DNA-sekvens, men er sammensatt av store matriser (0.3-5 MB) med repeterende alphoid DNA bestående av 171-bp α-satellitt-DNA. Bortsett fra i spirende gjær, er cent identitet oppnås ikke av DNA-sekvensen, men ved tilstedeværelsen av en spesiell nucleosome som inneholder histon H3 varianten CenH3 (cent Protein A [CENP-A] i mennesker). 5 CENP-A nukleosomer lokalisere til indre plate av pattedyr kinetochores 7 og binde seg til 171-bp α-satellitt DNA. Aktive sentromerer krever CENP-A-holdig nukleosomer til direkte rekruttering av et konstituerende cent-forbundet nettverk (ccan) og kinetochore proteiner, som sammen regulere feste av kromosomene til mitotisk spindel og påfølgende syklus progresjon gjennom spindel sjekkpunkt. I lys av det ovenstående bevis har CENP-A blitt foreslått å være den epigenetisk merket på cent 8; imidlertid, den prosessen som CENP-A er inkorporert into centromeric DNA og de faktorer som er ansvarlige for dette inkorporering ennå ikke er godt karakterisert. En kort cent-målsøkende domene (CATD) befinner seg i den histon fold region av CENP-A, og erstatning av det tilsvarende område av H3 med CATD er tilstrekkelig til direkte H3 til cent. 9. Flere studier antydet funksjonelle roller for post-translasjonell modifikasjon (PTM) av CENP-A 12-16; Men de molekylære mekanismene for disse PTMs av CENP-A i rekrutteringen til sentromerer ennå ikke er klarlagt. Vi har tidligere rapportert at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase aktivitet er nødvendig for CENP-A K124 ubiquitylation og lokalisering av CENP-A til sentromerer. 17 Oppdagelsen og karakterisering av kinetochore proteiner har ført til ny innsikt om kromosom segregering. 18 Mer enn 100 kinetochore komponentene har blitt identifisert i virveldyrceller ved ulike tilnærminger. 19,20 En understående av hvordan kinetochores montere og funksjon kommer også fra karakteriseringen av de cellulære funksjoner av hver cent-kinetochore proteiner og protein-protein-nettverket i cellene. 19 direkte visualisering og avansert avbildningsmetoder i fluorescens mikroskopi gir bemerkelsesverdig oppløsning av cent-kinetochore komponenter og tillate direkte observasjon av spesifikke molekylære komponenter av sentromerer og kinetochores. I tillegg er fremgangsmåter for indirekte immunfluorescens (IIF) farging ved hjelp av spesifikke antistoffer er avgjørende for disse observasjonene. Men til tross for mange rapporter om IIF protokoller, få diskutert i detalj problemer med spesifikke cent-kinetochore proteiner. 1-4 Dermed utvikle og rapportering metoder for IIF flekker og en kvantitativ IIF analyse for å spesifikt analysere hver cent-kinetochore protein er ekstremt viktig. I IIF farging, bør man fortsette med fargingen protokollen for å unngå tap av proteinet av interesse ellerresten av cellen. Imidlertid ødelegger fiksering antigene seter fra tid til annen, og forskjellige antistoff-antigen kombinasjoner fungerer dårlig med en fikseringsmiddel, men svært godt med hverandre, 21 og valg av bindemiddel avhenger i stor grad av protein (er) av interesse. Derfor ulike festing metoder er avgjørende i IIF farging av cent-kinetochore proteiner. Her optimaliserte fremgangsmåter for indirekte immunfluorescens (IIF) farging, og en analyse for å adressere lokalisering av endogene cent-kinetochore proteiner, inkludert CENP-A og Flagg-merkede eksogene CENP-A-proteiner, og kvantifisering av disse proteiner i humane celler har blitt utviklet. Disse metodene kan brukes til analyse av cent-kinetochore proteiner i andre arter.

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Immunofluorescensanalyse av endogent CENP-A støtter den hypotese at CUL4A-E3-ligase er nødvendig for lokalisering av CENP-A til sentromerer Våre nyere studier viste at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase aktivitet er nødvendig for ubiquitylation av lysin 124 (K124) på CENP-A og lokalisering av CENP-A til sentromerer. 17 I utgangspunktet var det inter-cent kompleks (ICEN) isolert av anti-CENP-A: innfødt kromatin immunopresipitering, 32-34 og det ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins at JoVE.com

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Immunofluorescensanalyse av Endogene og eksogene cent-kinetochore Proteiner

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Bruk av Enzymatisk Biosensors å kvantifisere Endogent ATP eller H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; I Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Fjerning av eksogene materialer fra den ytre delen av frosne kjerner for å undersøke den gamle biologiske samfunn skjult Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Co-immunoprecipitation analysen bruke endogene kjernefysiske proteiner fra celler kultivert Hypoxic vilkår

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualisering og sporing endogene mRNAs i live Drosophila melanogaster egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Kvantitativ Immunoblotting cellen linjer som Standard til å validere Immunofluorescence for kvantifisering biomarkør proteiner i rutinemessig vevsprøver

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Sekvensiell Immunofluorescence og immunhistokjemi på Cryosectioned sebrafisk embryo

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...