Name: immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH GM68418 subvención.

1. Cultivo de células y transfección <ol><li> Ponga una tapa de vidrio (22 mm x 22 mm) en una placa de poliestireno de 6 pocillos. escudo opcionalmente una cubierta de vidrio con poli-L-lisina, 0,1% w / v, en agua (ver Lista de Materiales / Equipo) para mantener las células mitóticas en la cubierta de vidrio siguiendo los siguientes pasos: Nota: Las condiciones óptimas deben determinarse para cada línea celular y aplicación. <ol><li> superficie de cultivo capa asépticamente con poli-L-lisina, 0,1% w / v...

En los últimos años muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos de microscopía cuantitativa de células fijadas. 42 El progreso en la biología centrómero-kinetochore a menudo requiere una comprensión de la función específica del centrómero o-kinetochore específico de proteínas de las cuales subcelular regulación espacial-temporal refleja las cambiantes funciones de estas proteínas durante el ciclo celular. Por lo tanto, aquí hemos desarrollado métodos de tinción de IIF y un ensayo cuan...

&quot;Los centrómeros&quot; se define clásicamente como regiones de recombinación meiótica suprimida en genética y más tarde reconocidos como la constricción principal de cromosomas mitóticos, que desempeña un papel esencial en la segregación cromosómica precisa durante la mitosis. &quot;Kinetochores&quot; se describieron como las estructuras de capas múltiples que se unen a los microtúbulos en la superficie de centrómeros, como se revela por microscopía electrónica; &quot;cinetocoros&quot; se definen como más tarde el complejo macromolecular que se localiza en el centrómero de los cromosomas mitóticos. A pesar de una divergencia dramática de secuencias de ADN centroméricas entre los vertebrados, la estructura y composición kinetochore están muy conservadas. Se requiere una interacción dinámica entre los microtúbulos del huso y el cinetocoro fieles a la segregación de los cromosomas durante la mitosis, y defectos en la función del centrómero-cinetocoro plomo a aneuploidía y por lo tanto el cáncer. El centrómero en la mayoría de los eucariotasno tiene ninguna secuencia de ADN definida, pero se compone de grandes matrices (0,3-5 Mb) de ADN repetitivo alfoide consiste en ADN α-satélite de 171 pb. Excepto en la levadura en ciernes, la identidad centrómero se logra no por la secuencia de ADN, pero por la presencia de un nucleosoma especial que contiene la variante de la histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] en los seres humanos). 5 nucleosomas CENP-A localizar a la placa interior de los cinetocoros de mamíferos y 7 se unen al ADN α-satélite de 171 pb. centrómeros activos requieren que contiene CENP-A-nucleosomas para dirigir el reclutamiento de una red constitutiva centrómero-asociado (CCAN) y las proteínas del cinetocoro, que junto a regular la unión de los cromosomas al huso mitótico y la progresión del ciclo posterior a través del eje de control. A la luz de la evidencia anterior, se ha propuesto CENP-A sea de la marca epigenética del centrómero 8; sin embargo, el proceso por el cual CENP-A se incorporó into ADN centromérica y los factores responsables de esta incorporación aún no han sido bien caracterizados. Un dominio corto centrómero de segmentación (CATD) reside en la histona región de CENP-A veces, y la sustitución de la región correspondiente de H3 con la CATD es suficiente para H3 directa al centrómero. 9 Varios estudios sugieren papeles funcionales para después de la traducción modificación (PTM) de CENP-A 12-16; sin embargo, aún no se han elucidado los mecanismos moleculares de estos PTMs de CENP-A en la contratación a centrómeros. Hemos informado anteriormente de que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 de CENP-A K124 ubiquitinación y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 El descubrimiento y caracterización de proteínas kinetochore han dado lugar a una nueva comprensión en cuanto a la segregación cromosómica. 18 Más de 100 componentes del cinetocoro se han identificado en células de vertebrados por varios enfoques. 19,20 Un bajoDe pie de cómo cinetocoros ensamblan y función también viene de la caracterización de las funciones celulares de cada red centrómero-kinetochore proteínas y proteína-proteína dentro de las células. 19 visualización directa y formación de imágenes avanzado métodos en microscopía de fluorescencia proporcionan notable resolución de los componentes centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de los componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción utilizando anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de numerosos informes acerca de los protocolos IIF, pocos problemas discutidos en detalle de proteínas específicas centrómero-cinetocoro. 1-4 Por lo tanto, el desarrollo y la presentación de informes métodos de tinción IIF y un ensayo cuantitativo IIF un análisis específico de cada proteína centrómero-cinetocoro es extremadamente importante. En la tinción de IIF, se debe proceder con el protocolo de tinción para evitar la pérdida de la proteína de interés oel resto de la célula. Sin embargo, la fijación destruye sitios antigénicos de vez en cuando, y diferentes combinaciones de anticuerpo-antígeno funciona mal con un solo fijador, pero muy bien con otra, 21 y la elección de fijador depende en gran medida de la proteína (s) de interés. Por lo tanto, los diferentes métodos de fijadores son cruciales en la tinción de las proteínas del centrómero IIF-cinetocoro. Se han desarrollado métodos Aquí optimizadas de inmunofluorescencia indirecta (IIF) tinción y un ensayo para abordar localización de las proteínas del centrómero-kinetochore endógenos, incluyendo CENP-A y las proteínas de CENP-A exógenos bandera de etiquetado, y la cuantificación de estas proteínas en las células humanas. Estos métodos se pueden aplicar al análisis de proteínas centrómero-kinetochore en otras especies.

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

El análisis de inmunofluorescencia de endógena CENP-A es compatible con la hipótesis de que se requiere Cul4A-E3 ligasa para la localización de CENP-A a centrómeros Nuestros estudios recientes demostraron que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 para la ubiquitinación de la lisina 124 (K124) en el CENP-A y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 Inicialmente, el complejo de interfase-centrómero (ICEN) fue aislado por anti-CE...

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Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Research

JoVE Journal

Biology

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ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine

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