Name: isolation, characterization and functional examination of the gingival immune cell network
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network at JoVE.com

Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.

Все экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе последующим необходимые принципы и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета, NIDCR / NIH. 1. Подготовьте заранее <ol><li> Подготовьте полной среде: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл ?...

<ol>
	<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity.">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li><li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals.">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li><li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontitis:+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis.">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li><li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis:+Keystones,+Pathobionts,+And+Host+Response.">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li><li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States:+2009+And+2010.">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li><li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+Errors+In+Immunity:+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity.">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li><li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease.">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li><li>Sharrow, S. O., Coligan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+Of+Flow+Cytometry+Data.">Analysis Of Flow Cytometry Data.</a> Current Protocols In Immunology. , (2001).</li><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss.">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss.">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+Immune+Axis:+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing.">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li></ol>

Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки ?...

Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба 1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов 2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет 2. Когда иммунного гомеостаза нарушается на десны, либо через повышенной восприимчивости хозяина и / или в присутствии дисбиотических микробных сообществ, воспалительного состояния, периодонтит возникает 3 4. Пародонтит является распространенным воспалительным заболеванием, что приводит к потере зуба сupporting структуры. В своих тяжелых формах она наблюдается примерно 10% от общей численности населения 5. Анатомический ключевые факторы, влияющие на периодонтита восприимчивости и прогрессирования оказалось трудным 6. Тем не менее, модели на животных были чрезвычайно полезны в понимании механизмов инициации пародонтита и прогрессирования 7. Модели могут быть использованы для определения ключевых клеточных популяций и молекулярные медиаторы, которые имеют жизненно важное значение для поддержания иммунного гомеостаза и развитие привода пародонтоза. Такое понимание превратит наше понимание десны конкретных контроля иммунного гомеостаза и углубить наше нынешнее понимание патогенеза заболевания.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">14058-11</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Scalpel Blades #10</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">10010-00</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Splinter Forceps</td>
			<td style="width:188px;">Integra Miltex</td>
			<td style="width:188px;">6-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Needles with regular bevel&#160;</td>
			<td style="width:188px;">BD Medical</td>
			<td style="width:188px;">305109</td>
			<td>27G, 12.7 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Monoject syringes</td>
			<td style="width:188px;">Covidien</td>
			<td style="width:188px;">8881513934</td>
			<td>Luer-lock tip, 3mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:188px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:188px;">10010-049</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:188px;">Lonza</td>
			<td style="width:188px;">12-167F</td>
			<td>Without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DNase I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:188px;">Gemini Bio-products</td>
			<td style="width:188px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin 50 mg/ml</td>
			<td style="width:188px;">Quality biological</td>
			<td style="width:188px;">120-098-661EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td style="width:188px;">Quality biological</td>
			<td style="width:188px;">351-027-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352070</td>
			<td>Polypropylene, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">70 &#956;M Cell Strainers</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">351029</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5 mL FACS tubes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352052</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD GolgiPlug</td>
			<td style="width:188px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:188px;">555029</td>
			<td>Contains brefeldin A solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ionomycin Calcium Salt</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">13909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Saponin from quillaja bark</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:188px;">Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">56-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">48-0042-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">47-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse gamma delta TCR FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5711-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse IL-17A APC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse IFN-&#947; PE</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">25-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">47-0902-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD3e FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD19 FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD11b FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD11c FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0114-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse TCR beta FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse Ly-6G FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse Ly-6C FITC</td>
			<td style="width:188px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:188px;">553104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and functional examination of the gingival immune cell network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

Чтобы проиллюстрировать применение протокола, мы показываем репрезентативные результаты Рассматривая сеть иммунных клеток в десне мышей с и без периодонтита (WT против LFA - / -, рис 2a - C). Представительные FACS графики показывают живые CD45 + гем...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network at JoVE.com

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.

Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Выделение функциональных сердечно иммунных клеток

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Изоляция, обработки и анализа мышиного десен Клетки

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для измерения иммунных ответов на малярией в контексте ВИЧ-инфекцией

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...