Name: standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende støtte fra victorianske regering Operative Support Infrastructure Program, den australske Forskningsråd Linkage Projects Scheme (med Agilent Technologies), Australian National Sundhed og Medical Research Council, den victorianske hjerne bank, Cooperative Research Centre for Mental Health og Neuroproteomics facilitet.

1. Fremstilling af buffere og prøver <ol><li> Forbered 500 ml buffer, 200 mM ammoniumnitrat pH 7,6 - 7,8 (pH justeret med ammoniumhydroxid (NH4OH)) med cæsium (Cs) og antinomi (SB) tilsat til en endelig koncentration på 10 ppb. Brug cæsium og antinomi som interne standarder til at overvåge for enhver tendens i svaret fra ICP-MS. Filter buffer før brug gennem et 0,22 um filter. </li><li> Forbered prøven, afhængigt af typen af ​​prøve: væske, væv eller cellekultur. <ol><li> For prøver, der kræver homogenisering (f.eks væv eller celler), sikre, at de ikke indeholder rengøringsmiddel. Brug Tris buffere for prøveforberedelse. Alternativt kan du bruge fosfat buffere, men de kan have en negativ indflydelse på metalloproteome over tid eller med fryse tø 12. </li><li> Homogenisere væv eller cellekultur prøver ved manuel dounce eller sonikering i 5 min under anvendelse af Tris-bufret saltvand (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumchlorid(NaCl) + ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) frie proteaseinhibitorer). </li><li> Præcisere homogenater ved centrifugering ved 16.000 x g i 5 min. Opsaml det resulterende supernatant. Opbevare prøver ved 4 ° C. Bemærk: Alle prøver skal centrifugeres før de lægges i højtydende væskekromatografi (HPLC) hætteglas til at forhindre partikler i at blokere søjlen gelpermeationskromatografi (SEC). </li></ol></li><li> Normalisere samlede mængde protein sat på søjlen tværs prøverne. Bestem proteinkoncentrationer ved 280 nm ved anvendelse af en mikro volumen UV spektrofotometer 13. Belastning mellem 20 og 150 ug protein. Anvende typiske injektionsvolumener fra 2 - 80 pi afhængig af koncentrationen prøven. <ol><li> Rengør prøve arm af mikro volumen UV spektrofotometer med destilleret vand før prøven læsning. Prøven arm er hvor proteinprøver er indlæst. </li><li> Blank instrumentet mod 2 pi the prøvepuffer. Derefter belastning 2 pi af hver prøve på armen, og absorbansen måles ved 280 nm. </li><li> Bestem koncentrationerne. For råprotein prøver, bruge en ekstinktionskoefficient på 1 Abs = 1 mg / ml. For at bestemme koncentrationen af ​​protein i prøverne, bruge Beer-Lambert lov, A = ε xlxc, hvor A er absorbansen, ε er ekstinktionskoefficienten, l er vejlængden i centimeter og c er koncentrationen. </li></ol></li></ol> 2. Bulk Analyse af metalloprotein Standarder Brug induktivt koblet plasma - massespektrometri <ol><li> Warm-up og tune instrumentet ved hjælp af fabrikantens protokoller. </li><li> Når instrumentet er varmet op og tunet, udføre hovedparten ICP-MS. Bemærk: Stamopløsninger af rensede metalloproteiner generelt skal fortyndes inden måling. Koncentrationen af ​​standarden metal kan estimeres ud fra det kendte protein: metal stochiometries og den anslåede protein koncention. Denne information kan anvendes til at bestemme den fortynding, vil være hensigtsmæssigt at falde inden for området af standardkurven genereret. <ol><li> Fortynd metalloprotein standarder, thyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD og vitamin B 12, for at sikre, at de falder inden for intervallet på 0 - 500 ug / l, under anvendelse af 1% salpetersyre. For at opnå standarder inden for dette område, skal du ikke bruge fortyndinger overstiger 1 i 20. Udfør seriefortyndinger i vand for at fortynde de bestande, forud for dette, hvis det kræves. </li><li> Opsætning rækkefølgen af ​​injektioner. Først analysere de syv kalibreringsindhold, koncentrationer fra 0 - 500 ug / l, efterfulgt af metalloprotein standarder. De syv kalibreringsindhold er 0, 1, 5, 10, 50, 100 og 500 ug / l. </li><li> Vælg elementer af interesse. Her, brug Fe, Cu, Zn, Co og jeg, da de er de elementer, som de proteinstandarder er bundet til. Vælg elementerne i overtagelsesmetoden ved at åbne fanen element selector og tilføje eleme<html> nts og deres respektive isotop masser, som skal analyseres. </li><li> Udfør analysen med instrumentet og instrumentet software skaber automatisk kalibreringskurverne for hver af de elementer, der analyseres. Kalibreringskurverne er skabt af softwaren ved at plotte tællinger / sek af den detekterede mod mængden af ​​metal, at standarden er beregnet til at indeholde, i ug / L metal. Brug kalibreringskurverne for at bestemme koncentrationen af ​​metal i de ukendte prøver. Bemærk: Brug af kalibreringskurven, softwaren bestemmer koncentrationen af ​​metal i hver af de metalloprotein standarder. </li><li> Fra bulk analyseresultater, generere metalloprotein standarder, der omfatter de tre hyppigst forekommende sporstoffer i mammale væv under anvendelse af en blanding af Cu, Zn superoxiddismutase (SOD) fortyndet til 200 ug / l af kobber og zink og ferritin (FTN) i en endelig koncentration på 2.000 ug / l jern. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. HPLC Systemopsætning og gelpermeationskromatografisøjle Ekvilibreringstid Bemærk: Dette afsnit skal udføres parallelt med den tidligere, da de begge krævede omkring 1-1,5 time at fuldføre. <ol><li> Purge HPLC-pumper med puffer fremstillet i trin 1.1 og rense pumperne i 5 minutter ved en strømningshastighed på 5 ml / min. </li><li> Når systemet er renset, indstilles strømningshastigheden ved 0,1 ml / min og forbinde kolonnen størrelse eksklusion (4,6 x 300 mm, 3 um, 150 A). Bemærk: En våd forbindelse mellem slangen og søjlen undgår eventuelle luftbobler blive fanget under forbindelse af søjlen. </li><li> Slut den modsatte ende af kolonnen til UV-detektor indstillet til at måle absorbans ved 280 nm ved anvendelse PEEK slangen. </li><li> Gradvist øge strømningshastigheden af ​​søjlen i trin på 0,05 - 0,1 mL / min, indtil en endelig strømningshastighed på 0,4 ml / min er nået. Mens dette sker, skal du kontrollere slangeforbindelser til kolonnen for lækager. Overvåg trykketaf systemet for at sikre, at det ikke overstiger kolonnen krav ved at observere det tryk spor på kromatogrammet i softwaren. </li><li> Efterlad kolonnen i ligevægt ved den krævede strømningshastighed over 5 - 10 søjlevolumener. Når den er i ligevægt, forbinde instrumenterne til at tillade analysen at forekomme. </li><li> Opsætning af HPLC-metoden for at pumpe buffer A over søjlen ved 0,4 ml / min i 15 min. </li></ol> 4. Opsætning og Running Størrelse Udelukkelse - induktivt koblet plasma - massespektrometri Bemærk: Operationelle procedurer kan variere mellem instrumenter og modeller. Kontakt instrumentet teknisk specialist at lære mere om, hvordan du konfigurerer ICP-MS bliver brugt. <ol><li> Placer ICP - MS i standby, før du ændrer indstillingen hardware. <ol><li> Når du er i standby-tilstand, skal du slukke for kommunikation for auto sampler og ændre prøven introduktion til &quot;andet&quot;. Bemærk: Afhængigt af den software og hårdtware-konfiguration vælge &quot;HPLC&quot; som en prøve introduktion kilde kan bruges. Kontakt instrumentet teknisk specialist at lære, hvis denne indstilling er tilgængelig. </li></ol></li><li> Brug PEEK slangen (ID 0,13 mm) til at tilslutte ud flow fra UV-detektor direkte til forstøveren på ICP-MS. </li><li> Power sikkerhedskopiere ICP - MS og lade instrumentet varme op i 10 - 20 min. </li><li> Efter plasma har antændt, tilslut den eksterne kabel fra ICP - MS til bagsiden af ​​HPLC-autosampleren. Gør dette når plasmaet har antændt; ellers HPLC-systemet vil automatisk lukke ned, da ICP - MS ikke er på. </li><li> Ændre ICP-MS metode til at indsamle data til LC-ICP-MS. <ol><li> Alter overtagelsesmetoden fra spektrum til tiden løse erhvervelse (TRA). </li><li> Vælg de elementer, der skal analyseres, Fe, Cu, Zn, Co, jeg samt andre elementer af interesse, og der er integration gange (typisk mellem 0,05 til 0,3 sek). Efter de elementer af interesse enre valgt, justere erhvervelse tid til at matche køretiden for kromatografi (f.eks 900 sekunder ved en 15 min kromatografi køre). </li><li> Manuelt tune ICP - MS for følsomhed og kollisionscelle helium (He) strømningshastigheder med kromatografi puffer strømmende hjælp Cs og Sb inkluderet i bufferen. He strømningshastigheder er typisk ~ 1 ml / min mindre end dem, der anvendes for massegods analyse. Når metalionkomplekserne tællinger har stabiliseret og relativ standardafvigelse (RSD) værdierne er under 5%, er systemet klar til brug. </li></ol></li><li> Gør prøve køre lister i både HPLC og ICP-MS softwareprogrammer. Prøven køre listen indeholder den rækkefølge, som hver af prøverne skal injiceres, samt det navn, som dataene skal gemmes. Kontroller, at det samlede antal prøver på listen match mellem de to programmer. </li><li> Start prøven hold for den ICP-MS før HPLC, idet injektion af prøven ved HPLC vil udløse ICP - MS at begynde at indsamledata. Hvis dette ikke sker i den rigtige rækkefølge det vil resultere i manglende data. </li><li> Generer kalibrering kurve point ved at injicere varierende mængder af SOD og FTN blandet standard fra 200 pg / L til 6000 mg / l injiceret på søjlen for Cu &amp; Zn og 2000 mg / l op til 60.000 mg / l for Fe. Injektionsvolumener spænder fra 1 til 30 pi. Bemærk: Disse koncentrationsintervaller omfatter koncentrationerne af Fe, Cu og Zn typisk observeret i komplekse homogenater. For prøver, der kun indeholder oprensede proteiner den maksimale rækkevidde af kurven skal justeres i overensstemmelse hermed. Da mængden af ​​metal er forbundet med proteinet kan kræve en mindre eller større rækkevidde, da der er mindre forurening i prøven fra andre faktorer. </li><li> Analyser hver af de ukendte prøver væv, plasma eller cellekultur. </li></ol> 5. Dataanalyse, Manipulation og visualisering <ol><li> Opbevar data i kommaseparerede værdier (CSV) filformat og indlæse into behandlingsprogrammer efter behov. </li><li> For at styre for instrument afdrift, opdele tællinger per sekund for hvert element af tællingerne per sekund for enten Cs eller Sb. </li><li> Generer kalibreringskurver for hver af elementerne. <ol><li> Bestem arealet under metal top, der svarer til den metalloprotein at den er bundet til for hver af injektionerne ved at udføre peak integration i den foretrukne dataanalyse software. </li><li> Plot området under metal top mod den totale mængde af metal, der blev sprøjtet på søjlen i hver kørsel, 200 - 6000 mg / l for Cu og Zn og 2000 - 60.000 mg / l for Fe. Udfør lineær regressionsanalyse på grundlag af softwaren protokollen. </li><li> Brug hældning resultater fra lineær regressionsanalyse som en faktor til at konvertere tællinger per sekund til pg / sek. Opdel hver af tællinger pr sekund datapunkter tværs kromatogrammet ved gradienten af ​​linjen værdi. </li></ol></li><li> Tegn data ipg / sek mod kromatogrammet tid. Bestem arealet under toppene af interesse. Arealet under toppen repræsenterer den totale mængde af metal, at proteinet er bundet til, i pg. </li><li> Generere en kalibrering baseret på molekylvægten af ​​de kendte metalloproteiner og det tidspunkt, hvor de elueres. Brug dette til at estimere størrelsen af ​​protein toppe i komplekse prøver. </li></ol>

<ol>
	<li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology.">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer's+disease.">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li><li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Treatment+with+CuII+(atsm)+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer's+disease+is+due+to+transferrin+desaturation.">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li><li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized.">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li><li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics:+challenges+and+approaches.">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li><li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection(SEC-ICP+MS).">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li><li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Cu-,+Fe-,+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy.">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li><li>Richarz, A. N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Sikring af indfødte tilstand af proteinet betyder særlig vægt på bufferne brugt og er nødvendige oplagring af prøven. Ikke alle kromatografiteknikker eller prøveforberedelse teknikker kan anvendes. Det er vigtigt, at de anvendte buffere hele prøveforberedelse og chromatografi er blottet for metalchelatorer og bruge buffere, som efterligner fysiologiske pH og saltkoncentrationer. Andre forhold for at undgå omfatte opvarmning prøven eller tilsætning af protein denatureringsmidler (f.eks urinstof). Det er afgørende at minimere antallet af fryse tø cyklusser. Evnen af ​​den valgte puffer til at binde divalente metaller er også vigtig og er en grund, Tris eller ammoniumnitrat buffere valgt frem phosphatbaserede puffere. Den lave opløsning og maksimal kapacitet gelpermeationskromatografi forhold til andre former for kromatografi er en væsentlig begrænsning ved denne teknik. Men den blide karakter størrelsesudelukkelse chromatograPHY er vigtigt at opretholde den native tilstand af proteinet og dermed bevare de relativt svage metal-protein-bindinger. Kravet om at opretholde den native tilstand af proteinerne kræver særlig opmærksomhed på behandlingen af de prøver, herunder begrænsning af antallet af fryse-tø-cykler, undgå metalchelatorer (f.eks EDTA) eller chaotrope salte og detergenter. Denne lav opløsning ved denne teknik påvirker evnen til at kvantificere mængden af ​​metal er forbundet med et specifikt protein, hvis det er i en kompleks prøve som toppunkterne vil indeholde mere end ét protein. Derfor vil mængden af ​​metal bestemmes ved anvendelse af peak integration være en indikation af den samlede mængde metal forbundet med alle proteinerne eluerede ved dette tidspunkt og ikke kun et specifikt protein. For at overvinde denne begrænsning skulle oprenses yderligere under native betingelser proteinet af interesse. Dette ville give mulighed for kvantificering afmetallet er forbundet med dette protein, der skal rapporteres med en højere grad af certainity. En anden potentiel begrænsning ved denne teknik ville være tab af protein på grund af ikke reversibel binding til søjlen. For at afgøre, om dette sker et opsving eksperiment bør udføres hvorved mængden af ​​protein eluerer fra søjlen analyseres for at bestemme, om dette svarer til beløbet injiceres. Det samme kan gøres ved at måle metalindholdet i elueringen materiale og udgangsmaterialet ved bulk ICP-MS. Genindvindingskolonnen kan variere afhængigt af de anvendte betingelser, men det har vist sig, at fuldstændig genvinding af proteiner fra en størrelse eksklusion søjle er mulig 9. Derfor er det vigtigt at kontrollere, om der er nogen tab under de driftsforhold, der anvendes. Modifikationer af protokollen kan relateres til de metalloprotein standarder, der anvendes, såvel som de elementer analyseres. Den type metalloprotein standard osed vil variere afhængigt af de elementer, der er af interesse. For elementer såsom Cu, Fe og Zn-proteiner, er SOD og ferritin anvendes. Enhver anden metalloprotein der har kendte stoichometries kan også anvendes og nogle få eksempler er blevet vist her. En væsentlig komplikation, der kan opstå som følge af anvendelse af denne teknik er opbygningen af ​​saltkrystaller i brænderen af ​​ICP-MS. For at forhindre ophobning af saltkrystaller, er faklen vaskes med destilleret vand efter hver 500 - 1000 ml buffer, som er blevet passeret gennem systemet, eller når det afgøres ved visuel inspektion, at faklen skal vaskes. Et andet problem, der kan opstå, er et hurtigere fald i renligheden af ​​prøven og udvinding kegler. Disse skal rengøres regelmæssigt efter fabrikantens protokoller. Den oprindelige prøveforberedelse er den mest kritiske trin i protokollen. Hvis der er nogen ændringer i protein - metal kompleks infsninger genereret vil ikke være gyldig. Dette er en af ​​de største begrænsninger af teknikken; Desuden er anvendelsen af ​​den lave opløsning, størrelseseksklusionssøjle giver en begrænset detaljeret afbildning af den sande kompleksitet metalloproteiner i biologi. Den her beskrevne teknik tillader udvidelse af kendskabet til metalloproteome af en organisme. Bulk analyse giver kun en rå indikation af ændringer i mængden af ​​metal i en prøve. Udover de almindelige hensyn, der skal tages i betragtning, giver denne teknik et værktøj, der kan anvendes til at kvantificere mængden af ​​metal er forbundet med proteiner samt identifikation metalloproteiner der afviger ved sammenligning sporene opnåede. Anvendelsen af ​​denne teknik kan anvendes til at identificere forskelle mellem sygdomstilstande. De identificerede metalloproteiner kan derefter undersøges nærmere for at hjælpe med at bestemme, hvilken rolle de spiller i sygdomsprocesser. Anvendelsen af ​​bindestreg ICP-MS har en voksendefremtiden at fastlægge den rolle, lægemidler, der har et heteroatom, såsom platin, iod eller kobber som ICP-MS kan anvendes til at identificere de proteiner, lægemidlet binder.

Essentielle metaller spiller en afgørende rolle i normale biologiske funktioner, herunder sekundære messenger veje, stofskifte veje og organel funktioner. 30% af alle proteiner menes at være metalloproteiner 1 og 50% af alle enzymer 2. Metalloenzymer bruger disse spormetaller som cofaktorer at katalysere kemiske reaktioner, stabilisere proteinstruktur, og for regulatoriske roller som sekundære budbringere. Nogle af de mest undersøgte sporstoffer i forhold til neurodegeneration er kobber, jern og zink 3. De menes at være involveret i mange smitteveje hvor ved dyshomeostasis kan have en negativ effekt. For eksempel metallet status superoxiddismutase (SOD) direkte påvirker levetiden og fænotypen af de transgene musemodeller af familiær type amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 4. I Alzheimers sygdom, er metalloproteomics teknikker blevet anvendt til at opdage et fald i metal status transferrin i pLasma 5. Disse undersøgelser fremhæver den vigtige rolle metalloproteiner kan spille i sygdom. Studiet af metalloproteiner direkte fra biologiske væv er et felt fremkaldning. Selvom nogle metalloenzymer er blevet karakteriseret, de fleste stadig karakteriseret eller ukendt 6. En af de store udfordringer i måling metalloproteiner er kravet om at opretholde den oprindelige tilstand af proteinet 7. Klassisk bottom-up proteomiske teknikker stole på fordøjelsen af ​​proteinerne til peptider. Denne proces afbryder den ikke-kovalent interaktion med metaller og deres proteiner. Således er ingen oplysninger om metal status af et protein vundet. En måde at overvinde dette problem er ved hjælp gelpermeationskromatografi parret med induktivt koblet plasma - massespektrometri 8,9 (SEC-ICP-MS). Dette genererer information om proteinets omtrentlige størrelse samt eventuelle metaller, der er Associated med det 10. Endvidere størrelseseksklusion er en blid kromatografisk teknik, der kan bevare den native tilstand af et enzym eller protein-protein-kompleks. En fordel ved anvendelse af induktivt koblet plasma - massespektrometri (ICP-MS) er den kvantitative beskaffenhed af teknologien. Anvendelse af et sæt metalloproteiner standarder er det muligt at tilvejebringe absolut kvantificering af metalloproteiner fra biologiske prøver 9,11. Dette opnås ved at generere en standardkurve ved indsprøjtning kendte metalloproteiner over et område af metalkoncentrationer. Denne procedure viser et eksempel på hvordan dette kan opnås for en række metalloprotein standarder. I dette papir vil vi skabe standardkurver for metaller, der i vid udstrækning undersøgt i biologiske områder, herunder jern (Fe), kobber (Cu), zink (Zn), iod (I), og cobalt (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Brugen af metalloprotein standarder tillader kalibrering af kolonnen størrelse eksklusion. Figur 1A viser elueringsprofilen for standarder thyroglobulin ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD og vitamin B 12 baseret på metallet, som de er bundet til (Fe, Co, Cu, Zn og i). Figur 1B viser kalibreringskurven for kolonnen størrelseseksklusion baseret på molekylvægten af proteinstandarder og deres elueringstid, præsenteret i form af elueringsvolumenet (Ve) divideret med det tomme volumen af kolonne (Vo). De proteiner, der anvendes til at generere denne standardkurve er concanavalin A, Konalbumin, ceruloplasmin, ferritin, SOD og thyroglobulin. Figur 2A viser elueringen af ferritin over et område på 2.000 - 60.000 pg af Fe injiceret på søjlen og figur 2D er den regressionsanalyse udført under anvendelse af pEAK-området. Figurerne 2B og 2C er elueringsprofilerne for Cu / Zn SOD for Cu og Zn og 2E og 2F er regressionen analyser genereres ved hjælp af arealer. Resultaterne af regressionsanalysen anvendes til at konvertere de rå data i tællinger / sek til pg / sek, så mængden af ​​metal er forbundet med proteinet kan bestemmes kvantitativt. Omdannelsen sker ved at dividere tællinger / sek ved hældningen af den lineære regression (fx 334,6 (tællinger / sek) x (sek / pg) kobber). Som nævnt kan denne teknik anvendes til at identificere metalloproteiner i komplekse biologiske prøver. Menneskelige hjerne og plasma har været underkastet denne teknik og figur 3 og 4 viser henholdsvis de opnåede resultater. Human hjerne adskilt ved SEC-ICP-MS er vist i figur 3A-3C, som hver repræsenterer en forskellig metal<html> interesse (Cu, Zn eller Fe). Figur 4A-4C viser sporene opnås, når humant plasma underkastes denne teknik. Kompleksiteten og overflod af prøven vil påvirke antallet af toppe, der er set. Som forventet plasma er domineret af nogle få metalloproteiner herunder ceruloplasmin og transferrin. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figur 1. Kalibrering af størrelsesudelukkelseskromatografi - induktivt koblet plasma - massespektrometri Brug Kendt metalloproteiner (A) Eluering profil for de metalloprotein standarder baseret på deres respektive metaller.. (B) Molekylvægt kalibreringskurve for proteinstandarder thyroglobulin (i), ferritin (ii), ceruloplasmin (iii), Konalbumin (iv), Cu / Zn SOD (v) og concanavalin A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figur 2. Anvendelse af Ferritin og Cu ​​/ Zn SOD som metalloprotein standarder for at bestemme mængden af Cu, Fe eller Zn associeret med metalloproteiner i en kompleks biologisk prøve (A) Eluering profil for ferritin over indsprøjtning område 2000 -. 60.000 mg / l af jern. (B) og (C) Elueringsprofil for Cu / Zn SOD over injektionsstedet området 200 - 6.000 ug / l af kobber og zink, hhv. (D), (E) og (F) viser regression analyseresultater for metallerne jern, kobber og zink, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Figur 3. Cu, Fe og Zn Metalloproteome for Human Brain. (A) Kobber spor (B) Jern trace (C) Zink spor. Eluering af protein standarder for hvert metal fremgår af den sorte spor med deres molekylvægt angivet under grafen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figur 4. Cu, Fe og Zn Metalloproteome for human plasma. (A) Kobber spor (B) Jern trace (C) Zink spor. Eluering af protein standarderne for hvert metal er vist ved den sorte spor med deres molekylvægt idicated under grafen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Standarder for Kvantitative Metalloproteomic Analyse Brug Size Udelukkelse ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Kvantitative Proteomics anvendelse af reduktiv Dimethylation for mærkning med stabile isotoper

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Kvantitative og kvalitative Undersøgelse af Particle-partikel vekselvirkninger Brug Kolloid Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

Au-Interaktion af SLP1 Polymerer og Monolayer fra<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS og AFM som Værktøjer til biomolekyle-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Brug kapillarelektroforese at kvantificere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøgelse<em&gt; Ægte kaffe</em&gt; Frø

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Måling af Particle Size Distribution i uklare Solutions af Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

Fabrikation og afprøvning af fotoniske termometre

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

Nanosponge Tunability i størrelse og Crosslinking tæthed

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Anvendelse af spænding i dynamisk lysspredning partikelstørrelse analyse

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Opsætning af kapillær elektroforese-induktivt koblet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS) til kvantificering af jernrødoxarter (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Forberedelse af nanopartikler til ToF-SIMS- og XPS-analyse

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...