Name: sequencing of plant wall heteroxylans using enzymic, chemical (methylation) and physical (mass spectrometry, nuclear magnetic resonance) techniques
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00
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This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).

2 - アミノベンズアミドとのW-ゾルAXSの還元末端の1標識は、（RE）シュガー残渣（2AB） <ol><li>それらの蛍光誘導体多糖主鎖の還元末端を変換するために65℃で2時間、1 MのNaBH 3 CN（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）（pHは5.5）の存在下で2AB（0.2 M）とW-ゾルAXSインキュベートします。 注意：それは水と接触しているときのNaBH 3 CNが有毒シアン化ガスを放出するように、次の?...

<ol>
	<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans.">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li><li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).</li><li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up?.">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?.</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li><li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses.">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li><li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylan+Biosynthesis:+News+from+the+Grass.">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li><li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemicelluloses.">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li><li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+(1&#8594;3)-+and+(1&#8594;4)-linked+&#946;-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat.">A (1&#8594;3)- and (1&#8594;4)-linked &#946;-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li><li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye,+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours.">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li><li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9:+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis.">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li><li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan.">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li><li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass.">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li><li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes.">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Topspin User Manual. , (2010).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS/MS+spectra+of+glycoconjugates.">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li><li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides,+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat,+that+contain+the+elements+----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----+or+----4)[alpha-+L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li><li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan.">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li><li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li></ol>

ほとんどのマトリックス相の細胞壁多糖類は、一見ランダムに植物種、発達段階および組織型3に応じて、非常に多様である（グリコシルおよび非グリコシル残基の両方を含む）の骨格を置換しています。多糖類は、第二の遺伝子産物であるので、それらの配列は、派生テンプレートされておらず、そのような彼らの配列決定のために、核酸およびタンパク質のために存在するとして?...

ヘテロキシランは、草の主壁とすべての被子植物3-6の二次壁の主要な非セルロース多糖類である多糖類のファミリーです。キシランの骨格は、その種類及びグリコシル（グルクロン酸（グルクロン酸）、アラビノース（ARAF））および非グリコシル（O-アセチル、フェルラ酸）の組織型、発生段階および種7に応じ残基の置換パターンが異なります。 小麦の壁は（ コムギ L.）の胚乳は、主にアラビノキシラン（AXS）（70％）と、（1→3）で構成されている（1→4）-β-D-グルカン（20％）、セルロースおよびheteromannansの少量で（2％ずつ）8。キシランバックボーンは、主に（主にO-2位およびより少ない程度にO-3位）置換モノおよびジ置換α-L-アラと（O-2およびO-3位）様々-未置換であってもよいですF残基9。ヘテロの還元末端（RE）（例えば、トウヒ（ ドイツトウヒ ））（例えば、 シロイヌナズナ ）双子葉植物からキシラン10と裸子植物11は、特徴的な四糖のグリコシル配列を含みます。 -β-D-XYL のp - （1→3）-α-L-RhaでのP - （1→2）-α-D-GalのP A-（1→4）-D-XYL pを。 （生物学的および工業用）ヘテロキシランの生合成と機能を理解するには、完全なタイプと置換のパターンだけでなく、還元末端（RE）のシーケンスを理解するためにキシランの骨格の配列を決定することが重要です。 端部（RE）とヘテロキシランの内部領域のグリコシル配列を低減する構造的特徴のために使用される特定の技術は、この原稿に記載されています。技術は、酵素（エンドキシラナーゼ）加水分解する前にヘテロキシラン鎖の還元末端（RE）（2アミノベンズアミド（2AB）で）タギングフォアに依存しています。特にRE配列決定のためのこのアプローチは、ました最初のニューヨーク研究所10,12-13によって報告されたが、現在は内部領域のシーケンシングを含むように拡張および分離のそのソースに関係なく、すべてのヘテロキシランにも等しく適用可能である確立された技術の組み合わせです。このアプローチは、（利用可能な）適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。 説明したように、本 ​​研究では、脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、1MのKOHを、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含みますRatnayakeでら （2014年）2。 FRSは、次に、メチル化され、両方のネイティブとメチル化オリゴ糖の詳細な構造分析は高速液体クロマトグラフィーを用いて、MALDI-TOF-MSの組み合わせを用いて実行ESI-QTOF-MS結合さW-及びKOH、ゾルの両方から放出されたオリゴ糖RP C-18カラムを使用してオンラインクロマトグラフィー分離およびESI-MS nを。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSは、核磁気共鳴（NMR）によって特徴づけられた消化しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 aminobenzamide (2AB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>A89804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>247677</td>
			<td>Hazardous, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>156159</td>
			<td>Hazardous, handle with care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endo-1,4-&#946;-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a)</td>
			<td>Megazyme (www.megazyme.com)</td>
			<td>E-XYTR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide (D2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP C18 Zorbax eclipse plus column&#160;</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td></td>
			<td>(2.1&#215;100 mm; 1.8 &#181;m bead size)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlex MALDI-TOF MS&#160;&#160; (Model - MicroFlex LR)</td>
			<td>(Bruker Daltonics, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(ESI) -(QTOF) MS&#160;&#160; (Model # 6520)</td>
			<td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI-MSn &#160;- ion-trap&#160; (Model # 1100 HCT)</td>
			<td>(Agilent, Palo Alto, CA).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin (version 3.0)-Biospin- software&#160;</td>
			<td>Bruker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (Model # 7890B)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing of plant wall heteroxylans using enzymic, chemical (methylation) and physical (mass spectrometry, nuclear magnetic resonance) techniques

このプロトコルは、ヘテロキシランのグリコシル配列（単数または複数）を終了（RE）を低減し、内部領域の特徴付けのために使用される具体的な手法について説明します。脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）1として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、Ratnayake らによって記載されているように、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含む1 M KOH ら （2014年）2。 2つの異なるアプローチは、（ 図1の概要を参照）を採用しています。最初に、インタクトなW-ゾルAXSは、元のRE主鎖糖残基にタグを2ABで処理し、次いで、それぞれ、オリゴ糖の還元2AB標識REと内部領域との混合物を生成するためのエンドキシラナーゼで処理しました。第2のアプローチでは、KOH、ゾルFRが最初に、続いて2ABで標識されたオリゴ糖の混合物を生成するために、エンドキシラナーゼで加水分解されます。両方から酵素的に放出（（非）タグ付けされた）オリゴ糖W-及びKOHゾルFRSは、MALDI-TOF-MS、RP-HPLC-ESI-QTOF-MSおよびESI-MS nの組み合わせを用いて実行されるその後のメチル化との両方の天然及びメチル化オリゴ糖の詳細な構造解析です。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSもまた、アノマーの設定に関する情報を提供し、核磁気共鳴（NMR）によって特徴付けられる消化しました。これらの技術は、適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。

ら Ratnayakeから、2AB標識W-ゾルAXSのエンドキシラナーゼ消化は2AB標識REオリゴ糖と（2ABラベルなし）未標識の一連キシラン鎖（ 図1の内部領域由来のオリゴ糖の混合物を生成します。 2）。クロマトグラフィー手法一連のその後の異性体の複雑な混合物を分画するために使用されます。最後に、MSの技術は、その後、MS n個技術により配...

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Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

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