Name: assessing specificity of anticancer drugs in vitro
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00
Duration: 9 min 39 s
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श्रीमती Alster, श्री Honrath और डॉ जियांग उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सराहना कर रहे हैं। भी सराहना की है डॉ Volz और उनके डिजिटल पीसीआर डिवाइस के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए डॉ Dandri के अनुसंधान समूह।

1. मिक्स संस्कृति युक्त दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और गैर-ट्यूमर कोशिकाओं तैयारी <ol><li> एक की स्थापना की सेल लाइन MPNST S462 5 से ट्यूमर कोशिकाओं का प्रयोग करें। गैर ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में 6.7 fibroblasts का प्रयोग करें </li><li> संस्कृति दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ मानक DMEM मध्यम में fibroblasts (बीएसए), 3 मिमी glutamine, 0.1 मिमी 2-mercaptoethanol, 500 यू / एमएल पेनिसिलिन, 500 ग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2 5-7। उप-संगम में 0.05% trypsin के साथ कोशिकाओं फसल और एक hemocytometer का उपयोग कर उन्हें गिनती। </li><li> 0.2 मिलीलीटर माध्यम में एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुएं में एक साथ 400 ट्यूमर कोशिकाओं और 1,600 गैर ट्यूमर कोशिकाओं मिश्रण। 5 दिनों के उपचार की अवधि में ट्यूमर कोशिकाओं का तेजी से विकास को ध्यान में रखते, ट्यूमर कोशिकाओं के प्रारंभिक अनुपात 25% पर स्थापित किया गया था। सेट अप 4 प्रत्येक दवा एकाग्रता के लिए दोहराता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2 हे / एन। </li></ol> 2. Druजी उपचार <ol><li> परीक्षण दवा के रूप में nilotinib का प्रयोग करें। DMSO में 0, 2, 4 और 20 मिमी nilotinib के शेयर समाधान तैयार करें। 5 मिलीलीटर DMEM मध्यम में 200 गुना करके उनमें से प्रत्येक पतला, देने का 0, 10, 20 और 100 सुक्ष्ममापी 6.7 2 गुना केंद्रित दवा समाधान। </li><li> अच्छी तरह से प्रत्येक से 0.1 मिलीग्राम के माध्यम से निकालें और मध्यम युक्त दवा की 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। अंतिम सांद्रता 0, 5, 10 और 50 माइक्रोन के हैं। 5 दिनों के लिए मध्यम युक्त दवा में कोशिकाओं incubating जारी रखें। </li><li> उपचार के अंत में, एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग जुड़ी कोशिकाओं का निरीक्षण किया और तस्वीरें ले। मध्यम दूर Aspirate, 0.2 मिलीग्राम पीबीएस के साथ एक बार बच चिपकने वाला कोशिकाओं धो लें। </li></ol> 3. डिजिटल पीसीआर के लिए डीएनए तैयारी <ol><li> हॉटशॉट 8 का उपयोग कोशिकाओं lyse। <ol><li> 50 μl क्षारीय सेल समाधान (25 मिमी NaOH, 0.2 मिमी EDTA) प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें। पन्नी के साथ कुओं सील। एक ओवन में या 30 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर 95 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। एक माइकर के तहत चेकoscope यकीन है कि कोई और अधिक बरकरार कोशिकाओं कुओं की सतह पर बने रहे बनाने के लिए। मामले में कोशिकाओं को पूरी तरह से lyse हीटिंग समय बढ़ाने या डिटर्जेंट जोड़ नहीं था। उन्हें -20 डिग्री पर एक बार रुक भी कोशिकाओं को तोड़ने बढ़ाता सी। </li><li> अच्छी तरह से समाधान (40 मिमी Tris-HC, पीएच 4.0) प्रत्येक को निष्क्रिय 50 μl जोड़ें। 10 से 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर प्लेट और एक पीसीआर साइक्लर में सूखे के यू-फार्म कुओं में सभी lysates स्थानांतरण। आसुत जल 20 μl के साथ lysates Reconstitute। </li></ol></li><li> बूंद-डायलिसिस 9 का उपयोग फीका बनाना <ol><li> मतलब ताकना आकार 0.025 माइक्रोन के साथ झिल्ली फिल्टर का उपयोग करें। </li><li> 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में चमकदार पक्ष के साथ आसुत जल पर फिल्टर फ्लोट। 5 मिनट के लिए फिल्टर गीले। ध्यान दे फिल्टर और पानी के बीच हवा के बुलबुले से बचने के लिए। </li><li> Pipet कदम 3.1.4 से प्रत्येक नमूने की पुनर्गठित lysates ध्यान से फिल्टर के 4 क्षेत्रों में से प्रत्येक पर पर। प्लेट कवर और 30 से 60 मिनट के लिए dialyze। </li><li> फिल्टर पर flipping और न ही बूंदों परेशान बिना फिल्टर के नीचे पानी दूर चूसना। </li><li> एक नई पीसीआर थाली के कुओं में lysate-बूंदों स्थानांतरण। एक पीसीआर साइक्लर में 10 से 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से डीएनए बूँदें सूखी। 10 μl पानी में lysates Reconstitute। </li></ol></li></ol> 4. डिजिटल पीसीआर <ol><li> इस तरह के डीएनए, बफर और आरटी पर परख मिश्रण के रूप में पिघलना जमे हुए घटकों, किसी भी उपलब्ध सेंट्रीफ्यूज की अधिकतम बल (उदाहरण के लिए, VWR मिनी सेंट्रीफ्यूज) पर 10 सेकंड के लिए नीचे स्पिन और फिर उन्हें बर्फ पर रहते हैं। </li><li> मास्टर डीएनए (तालिका 1) को छोड़कर सभी घटकों से युक्त मिश्रण तैयार करें। मृत मात्रा पर विचार करें और मास्टर मिश्रण लगभग 10% के लिए आवश्यक राशि से अधिक की गणना। ध्यान दें: प्राइमरों और जांच वाणिज्यिक किट में इस्तेमाल किया। </li><li> भंवर मास्टर मिश्रण है, किसी भी उपलब्ध सेंट्रीफ्यूज की अधिकतम बल (उदाहरण के लिए, VWR मिनी सेंट्रीफ्यूज) पर 10 सेकंड के लिए नीचे स्पिन और प्रत्येक के लिए 15 μl बांटनाएक 96 पीसीआर थाली की अच्छी तरह से। सभी lysate मास्टर मिश्रण युक्त कुओं के लिए प्रत्येक नमूने की (जो डीएनए होता है) जोड़ें। स्थानांतरण आरटी पर एक कारतूस का नमूना पक्ष पर एक कुएं में प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μl। </li><li> एक कारतूस का तेल पक्ष पर प्रत्येक कुएं में छोटी बूंद जनरेटर के तेल के 70 μl बांटना। गैसकेट के साथ कारतूस बंद करो और एक छोटी बूंद जनरेटर में पूरी सेटिंग जगह है। छोटी बूंद पीढ़ी की शुरुआत करें। </li><li> स्थानांतरण 40 μl एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के कुओं में छोटी बूंद-समाधान। एक पन्नी के साथ थाली को सील करने और एक पीसीआर साइक्लर में थाली जगह है। 105 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन तापमान सेट और 2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की दर रैंप। तालिका 2 में सेटिंग्स का उपयोग पीसीआर बाहर ले। बाद पीसीआर, एक छोटी बूंद रीडर में प्लेट हस्तांतरण और पढ़ना शुरू। वैकल्पिक रूप से, अप करने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट की दुकान। </li></ol> 5. ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात की गणना <ol><li> डिजिटल पीसीआर डेटा लोड और स्वत: Analys प्रदर्शनहै। </li><li> प्रत्येक परख के परिणामों को नियंत्रित मैन्युअल सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के एक आयामी और 2-आयामी वितरण का निरीक्षण करके, और यकीन है कि वे अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं और सीमा लाइनों सही स्थिति में थे। अपवर्जित परिणाम मानदंड को पूरा नहीं है, उदाहरण के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों का कोई स्पष्ट विभाजन, आगे के विश्लेषण से। एक एक्सेल शीट में जिसके परिणामस्वरूप अनुपात NF1 / RPP30 कॉपी करें। </li><li> 2 एक्स (1- NF1 / RPP30): के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात की गणना। </li></ol> ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात से 6. खुराक पर निर्भर बदलें <ol><li> प्रत्येक दवा एकाग्रता के लिए, 4 प्रतिकृति से मतलब है और मानक विचलन की गणना। साधन और दवा सांद्रता के खिलाफ मानक विचलन प्लॉट। </li></ol>

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The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

इन विट्रो में दवा विशिष्टता का आकलन करने के लिए इस genetic- और सेल आधारित उपकरण में महत्वपूर्ण कदम एक या एक से अधिक ट्यूमर विशिष्ट आनुवंशिक सुविधाओं का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात का दृढ़ संकल्प है। पारंपरिक प्ररूपी में 7 के विपरीत, आनुवंशिक विशेषताओं, विशिष्ट स्थिर और यों करने के लिए आसान कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर विशेष उत्परिवर्तन या प्रतिलिपि संख्या भिन्नता गैर ट्यूमर कोशिकाओं में ट्यूमर कोशिकाओं में विशेष रूप से, लेकिन नहीं मौजूद है। इस तरह की एक आनुवंशिक कलंक मज़बूती और ठीक उदाहरण के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, इस अध्ययन में प्रदर्शन के रूप में डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर। डिजिटल पीसीआर के लिए, डीएनए के उच्च शुद्धता आवश्यक नहीं है। हालांकि, Desalting और निरोधात्मक अणुओं को हटाने जो एक बूंद-डायलिसिस एक उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता जरूरी हैं। संयुक्त सेल और ड्रॉप-डायलिसिस, सरल और जल्दी है कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और इसलिए किसी भी मानक प्रयोगशाला में किया जा सकता है। कोशिकाओं Brea नहीं करते हैंअच्छी तरह से कश्मीर, अतिरिक्त उपचार ऐसे -20 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं ठंड, डिटर्जेंट जोड़ने या / और प्रोटीज का उपयोग कर के रूप में माना जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, NF1 जीन की विषमयुग्मजी विलोपन मात्रा का ठहराव के लिए ट्यूमर विशिष्ट सुविधा के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इसी तरह, अन्य जीन या loci के विलोपन का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, म्यूटेशन भी ट्यूमर कोशिकाओं को बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे मामले में, उत्परिवर्ती के लिए डिजिटल पीसीआर assays और सामान्य alleles बड़े पैमाने पर उनमें से प्रत्येक के लिए उनकी विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया जा करने की जरूरत है। ट्यूमर कोशिकाओं की खुराक पर निर्भर अनुपात दवा विशिष्टता या चयनात्मकता के लिए एक संकेत है। इसके अलावा, यह भी एक दवा (चित्रा 4) के लिए एक मिश्रित संस्कृति की कुल कोशिकाओं की प्रतिक्रिया से ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया निकालने में सक्षम बनाता है। यह निकासी रणनीति प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करने में तकनीकी समस्या के लिए एक समाधान (जो दोनों ट्यूमर और शामिल प्रदान करता है कोईएन ट्यूमर कोशिकाओं) दवा के परीक्षण के लिए। वर्तमान अध्ययन में प्रदर्शन किया इसलिए आवेदन संभावित हो सकता है इन विट्रो उपकरण में genetic- और सेल आधारित (1) दवा की खोज की है, जहां यह इन विट्रो में दवा विशिष्टता या चयनात्मकता का आकलन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है (2) व्यक्तिगत कैंसर केयर में जहां यह प्राथमिक संस्कृतियों में परीक्षण दवाओं सक्षम बनाता है और फलस्वरूप सहायक कीमोथेरेपी 4 में मादक पदार्थों से चयन करने के लिए योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, एक दवा के औषधीय तंत्र, इस उपकरण का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है क्योंकि कुछ आनुवंशिक परिवर्तन या एकाधिक आनुवंशिक परिवर्तन दवा-इलाज के दौरान पीछा किया जा सकता। व्यक्तिगत प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करने में कठिनाई एक कमी ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए एक सार्वभौमिक आनुवंशिक सुविधा है। हालांकि, पूरे जीनोम अनुक्रमण में आज के अग्रिम के साथ, सबसे अधिक बार बदल जीन और क्षेत्रों के आम ट्यूमर के लिए जाना जाता है। उदाहरण के लिए, सिर और गर्दन के बीचट्यूमर, 71%, 23% और 22% TP53, FAT1 में म्यूटेशन और CDKN2A जीन, और 60%, 34% और 26% CDKN2A, STK11 और PTEN क्रमश: 10 के जीन क्षेत्रों में विलोपन किया है। लक्षित अनुक्रमण या / और डिजिटल पीसीआर के माध्यम से 5 से 10 ऐसे जीन या / और क्षेत्रों स्क्रीनिंग इसलिए संभावना एक या एक से अधिक आनुवंशिक परिवर्तन जो व्युत्पन्न प्राथमिक संस्कृति में ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान करेगा। एक और सीमा प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए resected ट्यूमर के अक्सर अपर्याप्त राशि है। लाभप्रद सुविधाओं और genetic- के होनहार आवेदन क्षमता और सेल आधारित इन विट्रो उपकरण में अपनी सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए और इसके लिए इन विट्रो प्रकृति पर जोर दिया जाना चाहिए के बावजूद। उदाहरण के लिए, अंतर प्रभाव या ट्यूमर कोशिकाओं पर एक दवा की cytotoxicity मई बजाय प्रकार की कोशिकाओं में अंतर के कारण (बनाम श्वान कोशिकाओं fibroblasts) या उनकेअलग मूल (विभिन्न व्यक्तियों से)। मजबूत गैर ट्यूमर कोशिकाओं पर की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं पर एक दवा का असर भी सच है कि पूर्व के बाद से तेजी से बढ़ने से समझाया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन विट्रो व्यवहार में कोशिकाओं को मानव शरीर में कोशिकाओं की तुलना में अलग है और इसके परिणामस्वरूप, इन विट्रो मूल्यांकन के परिणामों बार नहीं या केवल आंशिक रूप से कर वास्तविक नैदानिक ​​स्थिति को दर्शाते हैं। इसलिए, प्रभावकारिता, cytotoxicity और संवर्धित कोशिकाओं के लिए प्राप्त दवाओं की विशिष्टता नहीं बल्कि बायोमार्कर प्रकृति के हैं लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के preclinically मापा प्रभावकारिता की विश्वसनीयता नहीं है। फिर भी, मिश्रित संस्कृतियों और / या प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सेल लाइनों से चलती दवा प्रभाव और इन विट्रो में विशिष्टता / चयनात्मकता का आकलन करने में एक कदम आगे है। व्यापक प्रयासों के साथ, इन विट्रो की स्थिति में पाया जा सकता है जो कम से कम कुछ दवाओं के लिए मरीजों की वास्तविक प्रतिक्रियाओं के साथ इन विट्रो डेटा का उचित संबंध में सक्षम बनाता।

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

दोनों ट्यूमर और गैर ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त संस्कृतियों का उपयोग कर इन विट्रो में विरोधी दवाओं की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है। प्रमुख तत्व मात्रात्मक एक दोहरे जांच डिजिटल पीसीआर परख और ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात के बाद गणना का उपयोग कर एक सार्वभौमिक दृश्य के लिए एक ट्यूमर विशिष्ट संबंध में आनुवंशिक परिवर्तन के दृढ़ संकल्प है। परख एक संस्कृति की स्थापना की एक लाइन का ट्यूमर कोशिकाओं और युक्त पर किया जाता है नुकीला में गैर ट्यूमर कोशिकाओं। मिश्रित संस्कृति विभिन्न सांद्रता में एक परीक्षण दवा के साथ व्यवहार किया जाता है। उपचार के बाद, डीएनए एक सरल और सस्ती विधि का उपयोग 96 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में बच चिपकने वाला कोशिकाओं से सीधे तैयार किया जाता है, और एक ट्यूमर विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन और एक संदर्भ के सार्वभौमिक अनुक्रम को मापने के लिए एक दोहरे जांच डिजिटल पीसीआर परख के अधीन । वर्तमान प्रदर्शन में, NF1 जीन की एक विषमयुग्मजी विलोपन ट्यूमर विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के रूप में प्रयोग किया जाता है औरसंदर्भ जीन के रूप में एक RPP30 जीन। अनुपात NF1 / RPP30 का प्रयोग, ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात की गणना की गई। चूंकि ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात के खुराक पर निर्भर परिवर्तन दवा की विशिष्टता के लिए इन विट्रो संकेत प्रदान करता है, यह आनुवंशिक और सेल आधारित इन विट्रो परख संभावना दवाओं की खोज में आवेदन क्षमता होगी। इसके अलावा, व्यक्तिगत कैंसर की देखभाल के लिए, इस genetic- और सेल आधारित उपकरण व्यक्तिगत ट्यूमर के प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग कर परीक्षण प्रभावकारिता और उम्मीदवार दवाओं की विशिष्टता के माध्यम से सहायक कीमोथेरेपी के अनुकूलन के लिए योगदान कर सकते हैं।

डीएनए की गुणवत्ता का उपयोग संयुक्त हॉटशॉट / ड्रॉप डायलिसिस संतोषजनक डिजिटल पीसीआर (चित्रा 1 बी) के लिए पर्याप्त है तैयार। 2,000 fibroblasts के लिए, लगभग 3,000 ± 500 सकारात्मक बूंदों प्राप्त किया गया है, उम्मीद 4,000 प्रतियां (एक कक्ष में दो प्रतियां) के 75% के लिए इसी। इस अध्ययन में, ट्यूमर कोशिकाओं की स्थापना की एक लाइन MPNST S462 जो NF1 जीन 5 का एक heterozygotic विलोपन के लिए जाना जाता से थे। यह 50% जीन खुराक में कमी स्पष्ट रूप से दोहरी डिजिटल पीसीआर परख (चित्रा 1 बी) द्वारा खोजा गया था। इसके विपरीत, इस जीन की दो प्रतियां fibroblasts में मापा गया। ट्यूमर और गैर ट्यूमर कोशिकाओं के बीच अंतर यह आनुवंशिक मिश्रित संस्कृतियों में ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 2) के अनुपात में की गणना के लिए सक्षम बनाता है। RPP30 को NF1 के रिश्तेदार जीन खुराक मापने के द्वारा, एक मिश्रित संस्कृति में ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात में निर्धारित किया जा सकताप्रत्येक दवा एकाग्रता में (चित्रा 3)। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> चित्रा 1. डिजिटल पीसीआर। (ए) के सिद्धांत का चित्रण। (बी) के एक दोहरे जांच परख लक्ष्य (NF1) एक संदर्भ (RPP30) जीन के संबंध में ट्यूमर कोशिकाओं MPNST S462 में जीन की कम राशि का पता चलता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> चित्रा 2. ट्यूमर कोशिकाओं की परिकलित अनुपात। ट्यूमर कोशिकाओं और गैर ट्यूमर कोशिकाओं विभिन्न अनुपात में मिलाया जाता है और एक 96-प्लेट के प्रत्येक कुएं में वरीयता प्राप्त थे। लगाव हे / एन, कोशिकाओं lysed थे बुद्धि के बादज हॉटशॉट / ड्रॉप डायलिसिस और desalted lysates डिजिटल पीसीआर जो NF1 / RPP30 के अनुपात दे दी है के अधीन थे। इस अनुपात के आधार पर, प्रत्येक कुएं में ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात की गणना की गई। मतलब है और 4 प्रत्येक सेट-अप अनुपात में प्रतिकृति से ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात के मानक विचलन की गणना की गई। ट्यूमर कोशिकाओं (शाफ़्ट) की गणना के अनुपात में सेट-अप अनुपात (एक्स अक्ष) के खिलाफ साजिश रची कर रहे थे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> चित्रा 3. खुराक पर निर्भर ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात से बदलें। (ए) खुराक पर निर्भर दिखाई महत्वपूर्ण कक्षों की कमी। (बी) के ट्यूमर कोशिकाओं का अनुपात (मतलब और 4 प्रतिकृति के मानक विचलन) की गणना से<html> NF1 के अनुपात: - 10 माइक्रोन के RPP30, 0 की रेंज में कमी आई है। उच्चतम खुराक 50 माइक्रोन में, कुछ महत्वपूर्ण कोशिकाओं सभी कोशिकाओं को विषाक्त प्रभाव के कारण, छोड़ दिया गया संभावना है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> । चित्रा 4 अलग गैर-ट्यूमर कोशिकाओं के उस से ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया (एक) व्यवहार्यता या / और कुल कोशिकाओं के प्रसार को पारंपरिक assays का उपयोग करके मापा जा सकता है; ट्यूमर कोशिकाओं का अनुपात प्रक्रिया वर्तमान अध्ययन में प्रदर्शन का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। (बी) के दो मापदंडों का उपयोग कर, एक दवा के लिए एक मिश्रित संस्कृति में कुल कोशिकाओं की प्रतिक्रिया ट्यूमर कोशिकाओं और गैर ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की प्रतिक्रिया में विभाजित किया जा सकता है।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 रिएक्शन </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 एक्स ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> NF1 के लिए परख मिश्रण </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> RPP30 के लिए परख मिश्रण </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> आधा </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> मास्टर मिश्रण </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> डीएनए </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> कुल </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> अंतिम पीसीआर मिश्रण </td></tr></tbody></table> तालिका 1 दोहरी ddPCR रिएक्शन की स्थापना <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> चरण </td><td> कार्य </td><td> तापमान </td><td> पहर </td><td> साइकिल </td></tr><tr><td> 1 </td><td> polymसक्रियण मिटा </td><td> 95 डिग्री सेल्सियस </td><td> दस मिनट </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> डीएनए विकृतीकरण </td><td> 94 डिग्री सेल्सियस </td><td> 30 सेकंड </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> एनीलिंग / exetension </td><td> 60 डिग्री सेल्सियस </td><td> 1 मिनट </td></tr><tr><td> 4 </td><td> पोलीमरेज़ छोड़ना </td><td> 98 डिग्री सेल्सियस </td><td> दस मिनट </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> पकड़ो (वैकल्पिक) </td><td> 4 डिग्री सेल्सियस </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> तालिका 2 पीसीआर Cycler सेटिंग

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के दोनों ट्यूमर और गैर ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त मिश्रित संस्कृतियों का उपयोग कर इन विट्रो में विरोधी दवाओं की विशिष्टता का आकलन करने के लिए है।

विरोधी दवाओं की विशिष्टता का आकलन<em&gt; इन विट्रो</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

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