Name: assessing specificity of anticancer drugs in vitro
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00
Duration: 9 min 39 s
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La signora Alster, il signor Honrath e il dottor Jiang sono apprezzati per la loro eccezionale assistenza tecnica. Anche apprezzato è il Dott Volz e il gruppo di ricerca del Dr. Dandri per fornire l&#39;accesso al dispositivo di PCR digitale.

1. Preparazione Culture Mix contenenti sia le cellule tumorali e cellule non tumorali <ol><li> Utilizzare le cellule tumorali da una linea di cellule stabilito MPNST S462 5. Utilizzare fibroblasti come le cellule non tumorali 6,7 </li><li> cellule Culture sia tumorali e fibroblasti in terreno standard DMEM con siero 10% fetale bovino (BSA), 3 mM glutammina, 0,1 mM 2-mercaptoetanolo, 500 U / ml di penicillina, 500 g / ml streptomicina e 1 mM sodio piruvato a 37 ° C e 5% CO 2 5-7. Al sub-confluenza, raccogliere le cellule con 0,05% tripsina e contarli con un emocitometro. </li><li> Miscelare 400 cellule tumorali e 1.600 cellule non tumorali insieme in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti in 0,2 ml di mezzo. Considerando crescita più rapida delle cellule tumorali nel periodo di trattamento di 5 giorni, la percentuale iniziale di cellule tumorali è stato fissato al 25%. Impostare 4 repliche per ogni concentrazione di farmaco. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. DruTrattamento g <ol><li> Utilizzare nilotinib come la droga test. Preparare soluzioni di 0, 2, 4 e 20 mm nilotinib in DMSO. Diluire ciascuno di loro di 200 volte in 5 ml DMEM media, dando 2-fold concentrate droga-soluzioni di 0, 10, 20 e 100 pM 6.7. </li><li> Rimuovere 0,1 ml di mezzo di ogni bene e aggiungere 0,1 ml di terreno contenente il farmaco. Le concentrazioni finali sono 0, 5, 10 e 50 pM. Continuare incubando le cellule in terreno contenente il farmaco per 5 giorni. </li><li> Alla fine del trattamento, ispezionare le cellule attaccate usando un microscopio a contrasto di fase e fotografare. Aspirare il mezzo di distanza, lavare le cellule sopravvissute adesivo una volta con 0,2 ml di PBS. </li></ol> 3. Preparazione del DNA per Digital PCR <ol><li> Lisare le cellule utilizzano HotShot 8. <ol><li> Aggiungere 50 ml soluzione alcalina lisi (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) in ciascun pozzetto. Sigillare i pozzetti con un foglio. Incubare la piastra a 95 ° C in un forno o su una piastra riscaldante per 30 min. Controllare sotto un MICRoscope per assicurarsi che non più cellule intatte rimaste sulla superficie dei pozzetti. Nel caso in cui le cellule non Lyse completamente, aumentano il tempo di riscaldamento o aggiungere detersivo. Congelare una volta a -20 ° C migliora anche la rottura delle cellule. </li><li> Aggiungere 50 ml soluzione neutralizzante (40 mM Tris-HC, pH 4,0) in ciascun pozzetto. Trasferire tutte lisati in U-forma pozzetti di una piastra PCR e secco in un cycler PCR a 95 ° C per 10 a 30 min. Ricostituire i lisati con 20 ml di acqua distillata. </li></ol></li><li> Desalt usando Drop-Dialisi 9 <ol><li> utilizzare filtri a membrana con media dimensione dei pori 0,025 micron. </li><li> Float il filtro acqua distillata con lato lucido in pozzetti di una piastra 12 pozzetti. Bagnare il filtro per 5 min. Prestare attenzione per evitare bolle d&#39;aria tra il filtro e l&#39;acqua. </li><li> Pipettare lisati ricostituiti di ciascun campione dal punto 3.1.4 delicatezza sulla su ciascuna delle 4 aree del filtro. Coprire la piastra e dializzare per 30 a 60 min. </li><li> Succhiare via l&#39;acqua sotto il filtro senza lanciare sopra il filtro né disturbare le gocce. </li><li> Trasferire il lisato-gocce in pozzetti di una nuova PCR-plate. Essiccare i DNA-gocce di riscaldamento a 95 ° C per 10 a 30 minuti in un ciclatore PCR. Ricostituire i lisati in 10 microlitri di acqua. </li></ol></li></ol> 4. Digital PCR <ol><li> componenti congelati Scongelare quali DNA, tampone e la miscela test a RT, centrifugare per 10 secondi alla massima forza di qualsiasi centrifuga disponibili (ad esempio, VWR minicentrifuga) e poi tenerli in ghiaccio. </li><li> Preparare la miscela master contenente tutti i componenti ad eccezione del DNA (Tabella 1). Considerare volume morto e calcolare miscela maestro circa il 10% in più rispetto l&#39;importo richiesto. Nota: utilizzare il primer e sonde utilizzate nel kit commerciale. </li><li> Vortex la miscela maestro, centrifugare per 10 secondi alla massima forza di qualsiasi centrifuga disponibili (ad esempio, VWR minicentrifuga) ed erogare 15 microlitri di ciascunpozzetto di una piastra a 96-PCR. Aggiungere tutto lisato (che contiene DNA) di ciascun campione ai pozzetti contenenti la miscela master. Trasferire 20 ml di ciascuna miscela di reazione in un pozzo sul lato campione di una cartuccia a RT. </li><li> Pipettare 70 ml di olio di generatore gocciolina in ogni pozzetto sul lato olio di una cartuccia. Chiudere la cartuccia con la guarnizione e posizionare l&#39;intera impostazione in un generatore di goccioline. Avviare la generazione delle gocce. </li><li> Trasferimento 40 ml di gocce-soluzione in pozzetti di una 96-pozzetti PCR. Sigillare la piastra con un foglio e mettere il piatto in un cycler PCR. Impostare il coperchio temperatura a 105 ° C e rampa velocità a 2 ° C / sec. Effettuare PCR utilizzando le impostazioni nella tabella 2. Dopo la PCR, trasferire la piastra in un lettore di gocce e iniziare a leggere. In alternativa, conservare la piastra a 4 ° C per 24 ore. </li></ol> 5. Calcolo percentuale di cellule tumorali <ol><li> Caricare il dati digitali PCR ed eseguire analys automaticiè. </li><li> Controllare i risultati di ogni test manualmente controllando la distribuzione unidimensionale e 2-dimensionale delle goccioline positivi e negativi, e assicurarsi che siano ben separati e le linee di soglia erano nelle giuste posizioni. Escludere i risultati che non soddisfano i criteri, per esempio, non netta separazione di goccioline positivi e negativi, da ulteriori analisi. Copiare il rapporto NF1 / RPP30 risultante in un foglio excel. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule tumorali come: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> 6. dose-dipendente Cambio di percentuale di cellule tumorali <ol><li> Per ogni farmaco-concentrazione, calcolare la media e la deviazione standard dei 4 repliche. Tracciare i mezzi e le deviazioni standard contro droga concentrazioni. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

Il passo fondamentale in questo strumento genetico-e a base di cellule per valutare la specificità dei farmaci in vitro è la determinazione della percentuale di cellule tumorali che utilizzano una o più caratteristiche genetiche tumore-specifici. In contrasto con le caratteristiche fenotipiche convenzionali 7, le caratteristiche genetiche sono specifiche, stabile e facile da quantificare. Ad esempio, una mutazione o variazione del numero di copie tumore-specifico è presente esclusivamente nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule non tumorali. Tale stigma genetico può essere affidabile e preciso quantificato, per esempio, utilizzando PCR digitale come dimostrato in questo studio. Per PCR digitale, ad alta purezza del DNA non è essenziale. Tuttavia, la demineralizzazione e rimozione molecole inibitrici sono necessarie che può essere raggiunto da un drop-dialisi utilizzando un filtro adatto. La lisi e drop-dialisi combinato è semplice e veloce, non richiede strumenti speciali e quindi può essere effettuata in qualsiasi laboratorio standard. Se le cellule non break bene, trattamento aggiuntivo può essere considerato come il congelamento delle cellule a -20 ° C, aggiungendo detergenti o / e con proteasi. Nel presente studio, la delezione eterozigote del gene NF1 è stato usato come la caratteristica tumore-specifico per la quantificazione. Analogamente, delezioni di altri geni o loci possono anche essere usati. Inoltre, le mutazioni possono essere utilizzati anche per quantificare le cellule tumorali. In tal caso, PCR digitali per il mutante e gli alleli normali devono essere ampiamente validato per garantire la loro specificità per ciascuna di esse. proporzione dose-dipendente delle cellule tumorali fornisce un&#39;indicazione per droga specificità o selettività. Inoltre, permette anche l&#39;estrazione di risposta delle cellule tumorali la risposta delle cellule totali di una coltura mista a un farmaco (Figura 4). Questa strategia di estrazione fornisce una soluzione al problema tecnico utilizzando colture primarie (che contiene sia tumore e noncellule n-tumorale) per la droga-test. La genetico-e a base di cellule in vitro strumento dimostrato in questo studio può quindi avere un potenziale di applicazione (1) in farmaco-discovery, dove fornisce una piattaforma per valutare la specificità di droga o di selettività in vitro e (2) nella cura del cancro personalizzato dove consente farmaci di prova in colture primarie e di conseguenza possono contribuire alla droga selezione in chemioterapia adiuvante 4. Inoltre, il meccanismo farmacologico di un farmaco può essere studiata utilizzando questo strumento, dal momento che alcune alterazione genetica o più alterazioni genetiche possono essere seguiti durante la droga-trattamento. Una difficoltà nel usando colture primarie individualizzati è la mancanza di una funzione genetica universale per la quantificazione delle cellule tumorali. Tuttavia, con l&#39;avanzata di oggi in tutto il sequenziamento del genoma, i geni e le regioni più frequentemente alterata sono noti per i tumori più comuni. Ad esempio, tra testa e collotumori, 71%, 23% e 22% hanno mutazioni nel TP53, FAT1 e geni CDKN2A, e il 60%, 34% e il 26% hanno delezioni in regioni geniche di CDKN2A, STK11 e PTEN, rispettivamente, 10. Screening 5 a 10 tali geni regioni e / o mediante sequenziamento mirato e / o PCR digitale pertanto probabile identificare uno o più alterazioni genetiche che possono essere utilizzati per la quantificazione delle cellule tumorali in coltura principale derivata. Un&#39;altra limitazione è la quantità spesso insufficiente di tumori resecati per la creazione di colture primarie. Nonostante le caratteristiche vantaggiose e promettente potenziale applicazione della genetico-e a base di cellule in vitro strumento, i suoi limiti devono essere tenuti in mente e la sua natura in vitro deve essere sottolineato. Per esempio, gli effetti differenziali o citotossicità di un farmaco sulle cellule tumorali può piuttosto per differenza di tipi di cellule (fibroblasti contro cellule di Schwann) o loroorigini diverse (da individui diversi). L&#39;effetto più forte di un farmaco sulle cellule tumorali rispetto a cellule non tumorali può essere spiegata dal fatto che il primo crescere più velocemente rispetto al secondo. Ancora più importante, le cellule in vitro comportamento è diverso rispetto alle cellule nel corpo umano e, di conseguenza, i risultati della valutazione in vitro spesso fanno non o solo in parte riflettere la reale situazione clinica. Pertanto, l&#39;efficacia, la citotossicità e la specificità dei farmaci ottenuti per cellule in coltura sono piuttosto dei biomarker natura, ma non hanno l&#39;affidabilità di efficacia preclinically misurata di antibiotici. Tuttavia, passando da linee cellulari di colture miste e / o in colture primarie è un passo avanti nella valutazione della droga-effetto e la specificità / selettività in vitro. Con grandi sforzi, in condizioni in vitro possono essere trovati che consente ragionevole correlazione dei dati in vitro con risposte reali di pazienti, almeno per alcuni farmaci.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

È dimostrata una procedura di valutazione specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture contenenti cellule sia tumorali e non tumorali. L&#39;elemento chiave è la determinazione quantitativa di un&#39;alterazione genetica tumore-specifica in relazione ad una sequenza universale usando un test PCR digitale dual-sonda e il successivo calcolo della percentuale di cellule tumorali. Il test viene eseguito su una coltura contenente cellule tumorali di una linea consolidata e spillo in cellule non tumorali. La coltura mista è trattato con un farmaco di prova a varie concentrazioni. Dopo il trattamento, il DNA viene preparato direttamente dalle cellule adesive sopravvissute in pozzetti di piastre da 96 pozzetti utilizzando un metodo semplice e poco costoso, e sottoposto ad un test PCR digitale dual-sonda per la rilevazione di una alterazione genetica tumore-specifica e una sequenza universale di riferimento . Nella presente dimostrazione, una delezione eterozigote del gene NF1 è usato come l&#39;alterazione genetica tumore-specifica eun gene RPP30 come gene di riferimento. Utilizzando il rapporto NF1 / RPP30, è stata calcolata la percentuale di cellule tumorali. Poiché il cambiamento dose-dipendente della percentuale di cellule tumorali fornisce un&#39;indicazione in vitro per la specificità del farmaco, questo test genetici e basato su cellule in vitro probabilmente avrà potenziali applicazioni per la scoperta di farmaci. Inoltre, per il cancro personalizzato-cura, questo strumento genetico-e a base di cellule può contribuire ad ottimizzare la chemioterapia adiuvante per mezzo di efficacia sperimentazione e la specificità dei farmaci candidati che utilizzano colture primarie di singoli tumori.

Qualità di DNA preparato utilizzando il HotShot combinato / Drop-dialisi è sufficiente per soddisfacente PCR digitale (Figura 1B). Per 2.000 fibroblasti, circa 3000 ± 500 goccioline positivi sono stati ottenuti, corrispondenti al 75% delle attese 4.000 copie (due copie di una cella). In questo studio, le cellule tumorali provenivano da una linea stabilita MPNST S462 che sono noti per avere una delezione eterozigote del gene NF1 5. Questa riduzione dosaggio genico 50% è stato chiaramente rilevato dal dual PCR digitale (Figura 1B). Per contro, due copie di questo gene sono state misurate in fibroblasti. Questa differenza genetica tra cellule tumorali e non tumorali consente di calcolare la proporzione di cellule tumorali in coltura mista (Figura 2). Misurando il relativo gene dosaggio di NF1 al RPP30, percentuale di cellule tumorali in una coltura mista può essere determinatoa ciascun farmaco-concentrazione (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figura 1. Digital PCR. (A) illustrazione del principio. (B) un test a doppia sonda rivela quantità ridotta di un gene bersaglio (NF1) in cellule tumorali MPNST S462 in relazione ad un gene di riferimento (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figura 2. Percentuale calcolata delle cellule tumorali. Le cellule tumorali e non tumorali cellule sono state mescolate a vari rapporti e seminate in ciascun pozzetto di una 96-piatto. Dopo l&#39;attaccamento O / N ingegno, le cellule sono state lisateh HotShot / Drop-dialisi e lisati dissalate sono stati sottoposti a PCR digitale che ha dato il rapporto di NF1 / RPP30. Base su questo rapporto, è stato calcolato proporzione di cellule tumorali in ciascun pozzetto. Media e deviazione standard della percentuale di cellule tumorali sono stati calcolati da 4 repliche con ogni proporzione di set-up. Le proporzioni calcolati di cellule tumorali (asse Y) sono stati riportati in funzione delle proporzioni di set-up (asse X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figura 3. dose-dipendente Cambio di percentuale di cellule tumorali. (A) dose-dipendente riduzione delle cellule vitali visibili. (B) percentuale di cellule tumorali (media e deviazione standard di 4 repliche) calcolata dalla<html> Rapporto di NF1: RPP30, diminuito nel range di 0-10 micron. Alla dose massima di 50 micron, poche cellule vitali sono stati lasciati, probabilmente a causa dell&#39;effetto tossico per tutte le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figura 4. Separazione risposta delle cellule tumorali da quella di cellule non tumorali (A) la vitalità o / e la proliferazione delle cellule totali può essere misurata con test convenzionali; Percentuale di cellule tumorali può essere determinata utilizzando la procedura ha dimostrato in questo studio. (B) utilizzando i due parametri, la risposta delle cellule totali in una coltura mista di un farmaco può essere diviso in risposta delle cellule tumorali e risposta delle cellule non tumorali..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reazione </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mix Assay per NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mix Assay per RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> totale parziale </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> miscela master </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Totale </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Finale Miscela PCR </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Installazione dual ddPCR Reazione <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Azione </td><td> Temperatura </td><td> Tempo </td><td> cicli </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymcancellare attivazione </td><td> 95 ° C </td><td> 10 minuti </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> denaturazione del DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sec </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Ricottura / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> 4 </td><td> polimerasi disattivazione </td><td> 98 ° C </td><td> 10 minuti </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (opzionale) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2 Impostazioni Cycler PCR

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture miste contenenti cellule sia tumorali e non tumorali.

Valutare Specificità di farmaci antitumorali<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ricerca

Medicina

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Protein Assay Conversion

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

L&#39;utilizzo di coniglio Occhi in farmacocinetiche Studi di intraoculari droga

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Drug Repurposing Ipotesi Generation Con il &quot;RE: Drugs sottili&quot; Sistema

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...