Name: assessing specificity of anticancer drugs in vitro
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00
Duration: 9 min 39 s
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La señora Alster, el Sr. Honrath y el Dr. Jiang son apreciados por su excelente asistencia técnica. También aprecia es el Dr. Volz y el grupo de investigación del Dr. Dandri para proporcionar el acceso a su dispositivo digital PCR.

1. Preparación de la mezcla de cultivo que contiene las células tumorales y células no tumorales <ol><li> Utilizar las células tumorales de una línea celular establecida TMVNP S462 5. Usa los fibroblastos como las células no tumorales 6,7 </li><li> Cultura tanto células tumorales y fibroblastos en medio estándar DMEM con 10% de suero fetal bovino (BSA), glutamina 3 mM, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina, 500 g / ml de estreptomicina y piruvato de sodio 1 mM a 37 ° C y 5% de CO 2 5-7. En sub-confluencia, cosechar las células con tripsina al 0,05% y contarlos utilizando un hemocitómetro. </li><li> Mezclar 400 células tumorales y 1.600 células no tumorales juntos en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos en 0,2 ml de medio. Teniendo en cuenta el crecimiento más rápido de las células tumorales durante el periodo de tratamiento de 5 días, la proporción inicial de las células tumorales se fijó en 25%. Configurar 4 repeticiones para cada concentración de fármaco. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tratamiento <ol><li> Utilice nilotinib como el fármaco de prueba. Preparar soluciones madre de nilotinib 0, 2, 4 y 20 mM en DMSO. Diluir cada uno de ellos por 200 veces en 5 ml de medio DMEM, dando 2-plegado de drogas soluciones concentradas de 0, 10, 20 y 100 mM 6,7. </li><li> Retirar 0,1 ml de medio de cada pocillo y añadir 0,1 ml de medio que contiene fármaco. Las concentraciones finales son 0, 5, 10 y 50 mM. Continuar la incubación de las células en medio que contenía fármaco durante 5 días. </li><li> Al final del tratamiento, inspeccionar las células unidas utilizando un microscopio de contraste de fase y tomar fotos. Aspirar el medio de distancia, se lavan las células adhesivas sobrevivido una vez con 0,2 ml de PBS. </li></ol> 3. Preparación de ADN para PCR Digital <ol><li> Lisar las células utilizando HotShot 8. <ol><li> Añadir 50 l solución de lisis alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada pocillo. Sellar los pozos con papel de aluminio. Incubar la placa a 95 ° C en un horno o en una placa de calentamiento durante 30 min. Compruebe debajo de un microscope para asegurarse de que no hay más células intactas permanecieron en la superficie de los pozos. En caso de que las células no se lisan por completo, aumentan el tiempo de calentamiento o añadir detergente. Congelarlos una vez a -20 ° C aumenta también romper las células. </li><li> Añadir 50 l de solución (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada neutralizantes también. Transferir todos los lisados ​​en forma de U pocillos de una placa de PCR y se seca en un ciclador de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir los lisados ​​con 20 l de agua destilada. </li></ol></li><li> Desalar mediante diálisis Drop-9 <ol><li> utilizar filtros de membrana con tamaño de poro promedio 0.025 micras. </li><li> Flotar el filtro en agua destilada con la parte brillante hacia arriba en pocillos de una placa de 12 pocillos. Mojar el filtro durante 5 minutos. Prestar atención para evitar burbujas de aire entre el filtro y el agua. </li><li> Pipetear los lisados ​​reconstituidas de cada muestra de la etapa 3.1.4 cuidadosamente sobre cada una de las 4 zonas de filtro. Cubrir la placa y se dializa durante 30 a 60 min. </li><li> Succionar el agua debajo del filtro, sin voltear sobre el filtro ni perturbar las gotas. </li><li> Transferir el lisado gotas en los pocillos de una nueva placa de PCR-. Secar las ADN-gotas por calentamiento a 95 ° C durante 10 a 30 min en un ciclador PCR. Reconstituir los lisados ​​en 10 l de agua. </li></ol></li></ol> 4. La PCR digital <ol><li> Descongele componentes tales como el ADN, tampón y la mezcla de ensayo a temperatura ambiente, dejen de girar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y luego mantenerlos en hielo. </li><li> Preparar la mezcla madre que contiene todos los componentes excepto el ADN (Tabla 1). Considere volumen muerto y calcular mezcla maestra aproximadamente un 10% más de la cantidad requerida. NOTA: Utilice los cebadores y sondas utilizadas en el kit comercial. </li><li> Vórtice la mezcla maestra, centrifugar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y prescindir de 15 l a cadapocillo de una placa de 96-PCR. Añadir todos lisado (que contiene ADN) de cada muestra a los pocillos que contienen la mezcla principal. Transferencia de 20 l de cada mezcla de reacción en un pozo en el lado de la muestra de un cartucho a TA. </li><li> Prescindir de 70 l de aceite de generador de gotas en cada pocillo de aceite en el lado de un cartucho. Cierre el cartucho con la junta y colocar toda la configuración en un generador de gotas. Iniciar la generación de gotitas. </li><li> Transferencia de 40 l de gota solución en pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos. Sellar la placa con papel de aluminio y colocar la placa en un termociclador de PCR. Establecer la tapa-temperatura a 105 ° C y velocidad de rampa a 2 ° C / seg. Llevar a cabo la PCR utilizando los ajustes en la Tabla 2. Después de la PCR, la transferencia de la placa en un lector de gota y empieza a leer. Alternativamente, la placa de almacenar a 4 ° C durante un máximo de 24 horas. </li></ol> 5. El cálculo de la proporción de células tumorales <ol><li> Cargar los datos de PCR digital y realizar analys automáticoses. </li><li> Control de los resultados de cada ensayo de forma manual mediante la inspección de la distribución unidimensional y 2-dimensional de las gotitas de positivos y negativos, y asegurarse de que están bien separados y las líneas de umbral estaban en las posiciones correctas. Excluir resultados no satisfacen los criterios, por ejemplo, hay una clara separación de las gotitas positivos y negativos, de los nuevos análisis. Copiar la relación NF1 / RPP30 resultante en una hoja de Excel. </li><li> Calcular la proporción de células tumorales como: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> Cambio 6. dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales <ol><li> Para cada fármaco-concentración, calcular la media y la desviación estándar de las 4 repeticiones. Trazar los medios y las desviaciones estándar contra el dopaje concentraciones. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

El paso clave en esta herramienta genético-y basado en células para la evaluación de especificidad fármaco in vitro es la determinación de la proporción de las células tumorales utilizando una o más características genéticas específicas de tumor. En contraste con características fenotípicas convencionales 7, las características genéticas son específicos, estable y fácil de cuantificar. Por ejemplo, una variación mutación o el número de copias específico de tumor está presente exclusivamente en las células tumorales pero no en células no tumorales. un estigma genético de este tipo puede ser fiable y precisa cuantificada, por ejemplo, usando PCR digital como se demuestra en este estudio. Para la PCR digital, de alta pureza de ADN no es esencial. Sin embargo, la desalinización y la eliminación de moléculas inhibidoras son necesarios que se puede lograr por una caída de la diálisis usando un filtro adecuado. La lisis y la caída de la diálisis combinado es simple y rápido, no requiere instrumentos especiales y por lo tanto puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio estándar. Si las células no break bien, el tratamiento adicional puede ser considerada como la congelación de las células a -20 ° C, la adición de detergente o / y el uso de la proteasa. En el presente estudio, se utilizó la deleción heterocigota del gen NF1 como la característica específica de tumor para la cuantificación. Del mismo modo, las deleciones de otros genes o loci también se pueden utilizar. Además, las mutaciones también se pueden utilizar para la cuantificación de células tumorales. En tal caso, los ensayos de PCR digitales para el mutante y los alelos normales necesitan ser ampliamente validado para asegurar su especificidad para cada uno de ellos. proporción dependiente de la dosis de las células tumorales proporciona una indicación para el fármaco-especificidad o selectividad. Además, también permite la extracción de la respuesta de las células tumorales a partir de la respuesta del total de células de un cultivo mixto a un fármaco (figura 4). Esta estrategia de extracción proporciona una solución para el problema técnico en el uso de cultivos primarios (que contiene tanto tumor y nocélulas n-tumor) para pruebas de drogas. El genético-y basados ​​en células in vitro herramienta demostrado en el presente estudio, por tanto, pueden tener un potencial de aplicación (1) en el descubrimiento de medicamentos donde proporciona una plataforma para evaluar la especificidad o selectividad de drogas in vitro y (2) en la atención personalizada del cáncer donde permite a los fármacos de ensayo en cultivos primarios y por lo tanto pueden contribuir a la selección de drogas en la quimioterapia adyuvante 4. Por otra parte, el mecanismo farmacológico de un medicamento puede ser estudiada usando esta herramienta, ya que cierta alteración genética o alteraciones genéticas múltiples pueden ser seguidos durante el tratamiento con fármaco. Una dificultad en el uso de cultivos primarios individualizadas es la falta una característica genético universal para la cuantificación de las células tumorales. Sin embargo, con el avance de hoy en la secuenciación de todo el genoma, los genes y las regiones más frecuentemente alterados son conocidos por tumores comunes. Por ejemplo, entre la cabeza y el cuellotumores, 71%, 23% y 22% tienen mutaciones en el gen TP53, FAT1 y genes CDKN2A, y el 60%, 34% y 26% tienen deleciones en las regiones de genes de CDKN2A, STK11 y PTEN, respectivamente 10. Screening 5 a 10 tales genes o / y regiones por medio de la secuenciación dirigida y / o PCR digital tanto, es probable identificar una o más alteraciones genéticas que se pueden usar para la cuantificación de células tumorales en el cultivo primario derivada. Otra limitación es la cantidad a menudo insuficiente de tumores resecados para el establecimiento de cultivos primarios. A pesar de las características ventajosas y su potencial aplicación prometedora de la genético-herramienta y en vitro basados ​​en células, sus limitaciones se deben tener en mente y su naturaleza in vitro deben ser resaltados. Por ejemplo, los efectos diferenciales o la citotoxicidad de un fármaco sobre las células tumorales puede más bien debido a la diferencia en los tipos de células (fibroblastos en comparación con las células de Schwann) o sudiferentes orígenes (de diferentes individuos). El efecto más fuerte de un fármaco sobre las células tumorales que en células no tumorales también puede explicarse por el hecho de que el primero crecen más rápido que el segundo. Lo más importante, las células en el comportamiento in vitro difieren de las células en el cuerpo humano y, en consecuencia, los resultados de la evaluación in vitro a menudo no o sólo parcialmente reflejan la situación clínica real. Por lo tanto, la eficacia, la citotoxicidad y especificidad de los medicamentos obtenidos para las células cultivadas son más bien de naturaleza biomarcador, pero no tienen la fiabilidad de la eficacia preclínica medido de antibióticos. Sin embargo, al pasar de líneas celulares a cultivos mixtos y / o cultivos primarios es un paso adelante en la evaluación de medicamentos de efecto y la especificidad / selectividad in vitro. Con grandes esfuerzos, en condiciones in vitro se puede encontrar que permite correlación razonable de los datos in vitro con las respuestas reales de los pacientes, al menos para algunos medicamentos.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Un procedimiento para evaluar la especificidad de medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos que contienen células tanto tumorales y no tumorales se demuestra. El elemento clave es la determinación cuantitativa de una alteración genética específica de tumor en relación con una secuencia universal, usando un ensayo de PCR digitales de doble sonda y el posterior cálculo de la proporción de células tumorales. El ensayo se lleva a cabo en un cultivo que contiene células tumorales de una línea establecida y enriquecida en células no tumorales. El cultivo mixto es tratado con un fármaco de ensayo a diversas concentraciones. Después del tratamiento, el ADN se prepara directamente a partir de las células adhesivas sobrevivido en pocillos de placas de 96 pocillos usando un método simple y de bajo costo, y se sometió a un ensayo de PCR digital dual de la sonda para la medición de una alteración genética específica de tumor y una secuencia de referencia Universal . En la presente demostración, una deleción heterocigota del gen NF1 se utiliza como la alteración genética específica del tumor yun gen RPP30 como el gen de referencia. Usando la relación NF1 / RPP30, se calculó la proporción de células tumorales. Puesto que el cambio dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales proporciona una indicación in vitro de la especificidad del fármaco, este ensayo genético y basado en células in vitro es probable que tenga potencial de aplicación en el descubrimiento de fármacos. Además, para el cuidado personalizado del cáncer, esta herramienta genético-y basado en células puede contribuir a la optimización de la quimioterapia adyuvante por medio de probar la eficacia y la especificidad de los fármacos candidatos utilizando cultivos primarios de tumores individuales.

Calidad de ADN preparado mediante el HotShot combinado / Drop-La diálisis es suficiente para digital PCR satisfactoria (Figura 1B). Para 2.000 fibroblastos, se obtuvieron aproximadamente 3.000 ± 500 gotitas positivos, que corresponde a 75% de los esperados 4.000 copias (dos copias en una célula). En este estudio, las células tumorales fueron de una línea establecida MPNST S462 que se sabe que tienen una deleción heterocigota del gen NF1 5. Esta reducción de la dosis del gen 50% se detectó claramente por el ensayo de PCR digital de doble (Figura 1B). Por el contrario, se midieron dos copias de este gen en los fibroblastos. Esta diferencia genética entre las células tumorales y no tumorales permite el cálculo de la proporción de células tumorales en cultivos mixtos (Figura 2). Mediante la medición de la dosis génica relativa de NF1 a RPP30, la proporción de células tumorales en un cultivo mixto puede determinarseen cada fármaco-concentración (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figura 1. PCR digital. (A) ilustración del principio. (B) un ensayo de doble sonda revela una cantidad reducida de un gen diana (NF1) en las células tumorales TMVNP S462 en relación con un gen de referencia (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figura 2. Proporción Calculado de células tumorales. Las células tumorales y no tumorales células se mezclaron en diversas proporciones y se sembraron en cada pocillo de una placa de 96. Después de la unión O / ingenio N, las células se lisaronh HotShot / Drop-diálisis y los lisados ​​desaladas se sometieron a PCR digital que dio la relación de NF1 / RPP30. La base en esta relación, se calculó la proporción de células tumorales en cada pocillo. La media y la desviación estándar de la proporción de las células tumorales se calculó a partir de 4 réplicas en cada proporción configuración. Las proporciones calculadas de las células tumorales (eje Y) se representaron frente a las proporciones de puesta a punto (eje X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figura 3. cambio de dosis-dependiente de la proporción de células tumorales. (A) dependiente de la dosis la reducción de las células vitales visibles. (B) la proporción de las células tumorales (media y desviación estándar de 4 réplicas) calculada a partir de la<html> relación de NF1: RPP30, disminución en el rango de 0 - 10 mM. En la dosis más alta de 50 mM, se dejaron pocas células vitales, probablemente debido al efecto tóxico de todas las células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figura 4. Separación de respuesta de las células tumorales de la de las células no tumorales (A) la viabilidad y / o proliferación de células totales se puede medir usando ensayos convencionales; Proporción de células tumorales se puede determinar usando el procedimiento demostrado en el presente estudio. (B) utilizando los dos parámetros, la respuesta del total de células en un cultivo mixto a un fármaco puede ser dividido en respuesta de las células tumorales y la respuesta de las células no tumorales..com / archivos / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reacción </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mezcla de ensayo para NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mezcla de ensayo para RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total parcial </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> mezcla maestra </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> ADN </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Final de mezcla de PCR </td></tr></tbody></table> Tabla 1 Configuración Dual ddPCR Reacción <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Acción </td><td> Temperatura </td><td> Hora </td><td> ciclos </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymborrar la activación </td><td> 95 ° C </td><td> 10 minutos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> desnaturalización del ADN </td><td> 94 ° C </td><td> 30 segundos </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> El recocido / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> 4 </td><td> desactivación de la polimerasa </td><td> 98 ° C </td><td> 10 minutos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (opcional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> La Tabla 2 Configuración Cycler PCR

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

El objetivo de este protocolo es evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos mixtos que contienen células tumorales tanto y no tumorales.

La especificidad de la evaluación de Medicamentos contra el cáncer<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Investigación

Medicina

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

El uso de ojos de conejo en el estudio farmacocinético de intraoculares Drogas

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Reutilización de drogas Hipótesis Generación Usando el &quot;RE: Drogas finas&quot; Sistema

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...