Name: analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level at JoVE.com

This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.

Remarque: Toutes les étapes doit être effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. S&#39;il vous plaît se référer à la section Réactifs pour plus de détails sur la façon de préparer des réactifs individuels. 1. Étiquetage L1 Sondes REMARQUE: Les sondes peuvent être marquées par un marquage chimique ou PCR. <ol><li> Marquage chimique <ol><li> Faire gel d&#39;agarose à 0,7-1% dans le tampon Tris-acét...

<ol>
	<li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li><li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition.">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li><li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+LINE-1+reverse+transcriptase:effect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain.">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li><li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition.">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li><li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition.">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li><li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1.">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li><li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells.">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li><li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA.">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li><li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro.">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li><li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome.">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome.">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li><li>Bojang, P., Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1.">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li><li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate.">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li><li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses.">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li><li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells.">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li><li>Bojang, P., Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13.">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li><li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes.">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li><li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved.">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li><li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators.">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li><li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe.">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li><li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin.">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li><li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize.">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li><li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine.">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li><li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells.">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li><li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma.">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li></ol>

Des méthodologies telles que le séquençage du génome entier, PCR inverse et dans le sud - blot ont été utilisées pour étudier L1 retrotransposition. Bien que ces méthodes sont extrêmement utiles pour localiser où insertions L1 se produisent dans les génomes, un défi de confusion pour chacun d&#39;eux est la nécessité pour la programmation in-silico pour réassembler des séquences. La méthodologie FISH décrite ici est conçue pour compléter ces méthodes, en particulier dans ...

Human long Interspersed nucléaire Element-1 (Line-1 ou L1) est un élément mobile autonome qui se propage dans le génome par un &quot;copier-coller&quot; mécanisme de retrotransposition. A L1 humain typique est environ 6 kb et consiste en un 5&#39;UTR (région non traduite) qui sert de promoteur, deux cadres de lecture ouverts (ORF): L1 et L1 -ORF1 -ORF2, et un 3&#39;UTR avec un polyA . queue L1 protéine -ORF1 a trois domaines distincts: un domaine bobine-bobine, ARN reconnaissance Motif et domaine C-terminal, alors que la protéine L1 -ORF2 a endonucléase, la transcriptase inverse et cystéine riches domaines 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 présente des activités chaperonnes d&#39;acide nucléique, tandis que L1 -ORF2 fournit des activités enzymatiques, avec les protéines nécessaires à la rétrotransposition 1,2,6. Un cycle de L1 retrotransposition commence par la transcription de la 5&#39;UTR de L1 </em&gt; ARNm bicistronique par l&#39;ARN polymérase II, translocation dans le cytoplasme, et la traduction. Dans le cytoplasme, L1 -ORF1 présente soit cis de liaison d&#39; où elle conditionne son propre ARN ou trans liaison d&#39; où elle emballe les autres ARN (c. -à- SINE / SVA / pseudogènes) pour former une particule de ribonucléoprotéine (RNP) avec L1 -ORF2p 7, 8. RNP translocation dans le noyau où l&#39;activité d&#39;endonucléase de L1 -ORF2p pseudos ADN génomique (ADNg) pour exposer un groupe OH - groupe 9, qui est à son tour utilisé par la transcriptase inverse pour amorcer et inverse l&#39; ARN synthétisent l&#39;ADN de l&#39; extrémité 3 &#39;. Lors de la synthèse inverse, le second brin d&#39;ADN est entaillé 7-20 pb à partir du site nick d&#39; origine pour créer des pauses décalées qui sont remplis pour former les signatures insertion L1 séquences (par exemple, TTTTAA) appelés duplications site cible (DNT) 9,10. Ce processus est connu comme cible principale transcription inverse (TPRT) et conduit à Insertisur des copies complètes ou tronquées de L1 / DNT avec d&#39; autres ADN aux deux extrémités de la séquence insérée L1 rétrotransposition a également été démontré. médié par TPRT analogue à la fin de jonction non homologue dans certains types de cellules 11. Le vecteur L1 rétrotransposition utilisé dans nos études est non épisomiques et se compose de tagged L1 -ORF1 &amp; 2p commandés par des promoteurs CMV L1-5&#39;UTR combinés (figure 1) 12. Les versions antérieures de cette construction ont été décrits dans des études utilisant des levures et des cultures de cellules humaines 13,14,15. Deux promoteurs CMV distincts situés aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; du vecteur, à l&#39;extrémité 3 &#39;placé dans une orientation inverse pour diriger l&#39;expression de la néomycine après épissage et d&#39;intégration. La cassette d&#39;indicateur de rétrotransposition à l&#39; extrémité 3 &#39; se compose d&#39;un gène inséré anti - sens à la néomycine L1 -ORFs et rendu inactif par séparation en deux moitiés par une bouledans l&#39; intron avec le donateur épissage (SD) et accepteur épissage (SA) sites (figure 1). Lors de l&#39; intégration dans un chromosome, L1 est transcrit à partir du promoteur commun pour produire un ARNm qui est constitué d&#39;un ARNm bicistronique et de l&#39; ARNm néomycine inactif. Au cours du traitement de l&#39;ARN, l&#39;intron de globine est épissé du gène de la néomycine pour restaurer un gène de néomycine complètement fonctionnel. L&#39;ARNm hybride est emballé dans un RNP en cis et translocation dans le noyau où il est intégré dans le génome comme étant soit pleine longueur ou tronquées insertions en utilisant TPRT. Nous décrivons ici une méthode qui utilise l&#39; hybridation fluorescente in situ (FISH) avec des sondes spécifiquement dirigés au gène de la néomycine épissé (Sneo) pour suivre les habitudes de -retrotransposiition L1 et les taux d&#39;insertion au niveau du noyau unique. L&#39;efficacité et la spécificité de la détection a été confirmée en utilisant retrotransposition compétent et constructions incompétents et sondes pour detect Sneo ou la néomycine et globine intron jonction 16. Cette méthodologie représente pour certaines des lacunes des tests de rétrotransposition à base de culture cellulaire, tels que des insertions multiples, la résistance des colonies et l&#39;expansion du clone favorable.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Labeling Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Tag DNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Tag 10X colorless buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Individual dNTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP10</td>
			<td>Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM&#160; in nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;dUTP-16-Biotin (0.5mM)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dUTP-FITC (0.5mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dUTP-CY3 (0.5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GEPA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRUS FISH Labeling Kit</td>
			<td>MIRUS</td>
			<td>MIR3625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRUS FISH Labeling Kit</td>
			<td>MIRUS</td>
			<td>MIR3225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1410/0030</td>
			<td>Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparing chromosome Spreads.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Colcemid&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15212-012</td>
			<td>Add Colcemid directly to growth media&#160; to a final concentration of 0.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy Fixative Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Point Marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2951-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>R001100</td>
			<td>To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slides&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Beaker (600ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS1003600</td>
			<td>Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>125690</td>
			<td>Any microscope can be used to look at spread quality.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials for FISH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chroride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detran Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement/Cytobond Sealant&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2020-00-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seven Coplin Jars</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; Dark Humidified chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS2551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slides&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Digital Heat Block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 &#181;m Filter paper. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;1mg/mL of Rnase A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Pepsin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve&#160; pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (4% PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 &#176;C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 &#181;m Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 &#176;C. Thaw aliquot of PFA at 37 &#176;C for 10-15 min for subsequent uses.&#160; Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.&#160; Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrating Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Un diagramme schématique du vecteur rétrotransposition L1 est présenté dans la figure 1. Le vecteur est constitué d&#39;un gène de la néomycine dans l&#39; orientation antisens par rapport à L1 ORFs qui est interrompu par un intron de globine dans l&#39; orientation sens et pris en sandwich par les sites SD et SA. Quand intégré de façon stable dans un chromosome, L1 ARNm est transcrit à partir du promoteur CMV et le combiné L1-5&#3...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level at JoVE.com

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Ici , nous utilisons la méthodologie FISH pour suivre LINE-1 retrotransposition au niveau des noyaux unique étalements de chromosomes de lignées cellulaires HepG2 exprimant de façon stable LINE-1 synthétique.

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Recherche

Biologie

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â» DNA at the Single Molecule Level

Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Sonder la cinétique de l’ARNm dans l’espace et le temps à Escherichia coli à l’aide de l’hybridation de fluorescence in situ à deux couleurs

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...