Name: analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level at JoVE.com

This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.

नोट: सभी चरणों के कमरे के तापमान पर बाहर किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट। कैसे व्यक्तिगत अभिकर्मकों तैयार करने पर जानकारी के लिए अभिकर्मकों अनुभाग को देखें। 1. लेबल एल 1 जांच <p class="jove_...

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	<li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element.">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li><li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition.">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li><li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+LINE-1+reverse+transcriptase:effect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain.">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li><li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition.">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li><li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition.">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li><li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1.">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li><li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells.">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li><li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA.">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li><li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro.">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li><li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome.">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li><li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome.">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li><li>Bojang, P., Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1.">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li><li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate.">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li><li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses.">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li><li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells.">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li><li>Bojang, P., Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13.">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li><li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes.">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li><li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved.">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li><li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators.">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li><li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe.">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li><li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin.">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li><li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize.">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li><li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine.">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li><li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells.">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li><li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma.">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li></ol>

इस तरह पूरे जीनोम अनुक्रमण, उलटा पीसीआर और दक्षिणी सोख्ता के रूप में के तरीके में एल 1 retrotransposition अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि इन तरीकों का पता लगाने के लिए जहां एल 1 सम्मिलन जीनोम क?...

मानव लांग बीच-बीच परमाणु तत्व-1 (लाइन -1 या एल 1) एक स्वायत्त मोबाइल तत्व है कि एक के माध्यम से जीनोम के भीतर प्रसारित &quot;कॉपी और पेस्ट&quot; retrotransposition तंत्र है। एक ठेठ मानव एल 1 ~ 6 KB लंबा है और एक 5&#39;UTR (untranslated क्षेत्र) है कि एक प्रवर्तक के रूप में कार्य करता है के होते हैं, दो खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs): एल 1 और एल 1 -ORF1 -ORF2, और एक Pólya के साथ एक 3&#39;UTR । एक तार-तार डोमेन, आरएनए मान्यता आकृति और सी टर्मिनल डोमेन, जबकि एल 1 -ORF2 प्रोटीन endonuclease है, ट्रांसक्रिप्टेज और सिस्टीन अमीर डोमेन 1,2,3,4,5 रिवर्स: एल 1 पूंछ -ORF1 प्रोटीन तीन अलग डोमेन है। एल 1 -ORF1 न्यूक्लिक एसिड निगरानी गतिविधियों को दर्शाती है, जबकि एल 1 -ORF2, enzymatic गतिविधियों प्रदान करता है retrotransposition 1,2,6 के लिए आवश्यक दोनों प्रोटीन के साथ। एल 1 retrotransposition का एक चक्र एल 1 के 5&#39;UTR से प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है </उन्हें&gt; शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, translocation कोशिका द्रव्य में, और अनुवाद के द्वारा bicistronic mRNA। कोशिका द्रव्य में, एल 1 -ORF1 दर्शाती है या तो सीआईएस -binding जहां यह अपने आप ही आरएनए संकुल या ट्रांस -binding जहां यह अन्य RNAs पैकेज (यानी, साइन / SVAs / pseudogenes) एल 1 -ORF2p 7 के साथ एक ribonucleoprotein कण (RNP) के रूप में, 8। RNPs नाभिक जहां एल 1 -ORF2p Nicks जीनोमिक डीएनए (gDNA) के endonuclease गतिविधि एक ओह को बेनकाब करने में सरकाना - समूह 9, कि प्रधानमंत्री को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा इस्तेमाल के बदले में है और 3 &#39;के अंत से डीएनए को synthesize आरएनए रिवर्स। रिवर्स संश्लेषण के दौरान, डीएनए का दूसरा किनारा कंपित टूट जाता है जो हस्ताक्षर एल 1 प्रविष्टि दृश्यों (जैसे, TTTTAA) नामक लक्ष्य साइट दोहराव (टीएसडी) 9,10 के लिए फार्म भर रहे हैं बनाने के लिए मूल निक साइट से 7-20 बीपी nicked है। इस प्रक्रिया के रूप में लक्ष्य प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन (TPRT) में जाना जाता है और inserti की ओर जाता हैTPRT-तरह गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के कुछ कोशिकाओं प्रकार 11 में डाला अनुक्रम के दोनों सिरों पर TSDs साथ एल 1 / अन्य DNAs का पूरा या छोटा प्रतियों की पर। एल 1 retrotransposition भी माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है। एल 1 retrotransposition हमारे अध्ययन में कार्यरत वेक्टर गैर episomal है और टैग एल 1 -ORF1 और 2p संयुक्त सीएमवी L1-5&#39;UTR प्रमोटरों द्वारा संचालित (चित्रा 1) 12 के होते हैं। इस निर्माण के पहले के संस्करणों खमीर और मानव सेल संस्कृतियों 13,14,15 का उपयोग अध्ययन में वर्णित किया गया है। दो अलग सीएमवी 5 &#39;और 3&#39; में स्थित प्रमोटरों, वेक्टर के समाप्त हो जाती है 3 &#39;के अंत के साथ रिवर्स उन्मुखीकरण में रखा splicing और एकीकरण के बाद neomycin की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए। 3 &#39;अंत में retrotransposition सूचक कैसेट एल 1 -ORFs करने के लिए एक neomycin जीन डाला antisense के होते हैं और एक ग्लोब द्वारा दो हिस्सों में जुदाई से निष्क्रिय प्रदान की गई हैspliced ​​दाता (एसडी) और spliced ​​स्वीकर्ता (एसए) साइटों (चित्रा 1) के साथ intron में। एक गुणसूत्र में एकीकरण पर, एल 1 आम प्रमोटर से लिखित है एक mRNA कि एक bicistronic mRNA और निष्क्रिय neomycin mRNA के होते हैं उपज है। आरएनए प्रसंस्करण के दौरान, ग्लोबिन Intron neomycin जीन से बाहर spliced ​​है एक पूरी तरह कार्यात्मक neomycin जीन बहाल करने के लिए। संकर mRNA सीआईएस में एक RNP में पैक और नाभिक जहां यह TPRT का उपयोग कर सकते हैं या तो पूरी लंबाई या छोटा सम्मिलन के रूप में जीनोम में एकीकृत है में translocated है। यहाँ हम एक पद्धति स्वस्थानी संकरण (मछली) जांच विशेष रूप से spliced ​​neomycin जीन (SNeo) के निर्देश पर साथ में प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है कि एक नाभिक स्तर पर एल 1 -retrotransposiition पैटर्न और सम्मिलन दरों को ट्रैक करने का वर्णन है। दक्षता और पता लगाने की विशिष्टता det को retrotransposition सक्षम और अक्षम निर्माणों और जांच का उपयोग कर पुष्टि की गईect SNeo या neomycin और Intron जंक्शन 16 ग्लोबिन। इस पद्धति में इस तरह के कई सम्मिलन, कॉलोनी प्रतिरोध और अनुकूल क्लोन विस्तार के रूप में सेल संस्कृति आधारित retrotransposition assays, की कमियों का एक कारण है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Labeling Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go Tag DNA polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Tag 10X colorless buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Individual dNTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP10</td>
			<td>Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM&#160; in nuclease free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;dUTP-16-Biotin (0.5mM)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dUTP-FITC (0.5mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dUTP-CY3 (0.5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GEPA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRUS FISH Labeling Kit</td>
			<td>MIRUS</td>
			<td>MIR3625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRUS FISH Labeling Kit</td>
			<td>MIRUS</td>
			<td>MIR3225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1410/0030</td>
			<td>Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparing chromosome Spreads.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160; Colcemid&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15212-012</td>
			<td>Add Colcemid directly to growth media&#160; to a final concentration of 0.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy Fixative Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Point Marker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2951-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>R001100</td>
			<td>To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slides&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Beaker (600ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS1003600</td>
			<td>Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>125690</td>
			<td>Any microscope can be used to look at spread quality.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials for FISH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chroride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detran Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement/Cytobond Sealant&#160;</td>
			<td></td>
			<td>2020-00-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seven Coplin Jars</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; Dark Humidified chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS2551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slides&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Digital Heat Block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 &#181;m Filter paper. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;1mg/mL of Rnase A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Pepsin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve&#160; pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (4% PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 &#176;C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 &#181;m Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 &#176;C. Thaw aliquot of PFA at 37 &#176;C for 10-15 min for subsequent uses.&#160; Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.&#160; Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrating Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of line-1 retrotransposition at the single nucleus level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

एल 1 retrotransposition वेक्टर के एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। वेक्टर एल 1 ORFs को antisense अभिविन्यास में एक neomycin जीन है कि भावना अभिविन्यास में एक ग्लोबिन Intron से बाधित और द्वारा एस...

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Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

एकल न्यूक्लियस स्तर पर लाइन -1 Retrotransposition का विश्लेषण

यहाँ हम HepG2 सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक सिंथेटिक लाइन -1 व्यक्त करने का गुणसूत्र फैलता में एकल नाभिक स्तर पर लाइन -1 retrotransposition ट्रैक करने के लिए मछली कार्यप्रणाली को रोजगार।

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

वायरल फ्यूजन कैनेटीक्स के मापन के लिए एकल कण स्तर पर विधि

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

वायुमंडलीय दबाव में मास स्पेक्ट्रोमेट्री से एकल कक्ष के प्रत्यक्ष विश्लेषण

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

पूरे सेल आबादी में एकल कोशिका के स्तर पर Cyclin बी के proteolysis अध्ययन

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

पुनः संयोजक प्रोटीन का उच्च स्तर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पौधे के कुशल Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

घन प्रोटोकॉल पूरा पर्वत त्वचा तैयारी में एकल कक्ष संकल्प पर प्रोटीन अभिव्यक्ति visualizes

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Zebrafish टाप में एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके बीटा-कक्ष फ़ंक्शन का विश्लेषण

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â» DNA at the Single Molecule Level

Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत visualizing-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एकल अणु स्तर पर

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

सीटू संकरण में दो रंग एकल अणु फ्लोरेसेंस का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में अंतरिक्ष और समय में एमआरएनए काइनेटिक्स की जांच करना

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...