Name: preparation of rat oligodendrocyte progenitor cultures and quantification of oligodendrogenesis using dual-infrared fluorescence scanning
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning at JoVE.com

גרנט חסות: מכוני הבריאות הלאומיים; מספר גרנט: R37 NS041435.

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) ואוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס הספר לרפואה. 1. הכנת צלחות assay, פתרונות המניות, ו OPC Media Base הערה: בסיס העכברוש OPC (סאטו) תקשורת המתוארת כא...

<ol>
	<li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification.">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-expressing+glial+progenitor+cells:+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS.">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li><li>Goldschmidt, T., Antel, J., K&#246;nig, F. B., Br&#252;ck, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity.">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li><li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery.">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li><li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2++glial+cells:+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain.">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li><li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells.">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li><li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve.">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li><li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+deficient+mice:+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin.">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li><li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+(Jimpy;+quaking;+Trembler;+shiverer+and+its+mld+allele)+obtained+by+zonal+centrifugation.">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li><li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+thyroid+hormone+&#946;+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation.">A selective thyroid hormone &#946; receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li><li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system.">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li><li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures.">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li><li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes.">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes.">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis.">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li><li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo.">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+glial+cells+during+CNS+development.">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li><li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte/neuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues.">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning.">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li><li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li></ol>

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה מהירה ואמינה לבידוד OPCs עכברוש וכימות ב oligodendrogenesis במבחנה בתגובה לגורמים הניסיונות. באמצעות סלקציה חיובית, תשואות גבוהות של OPCs קיימא וטהור משמשים במישרין למטרות ניסויים. שיטה זו מייעלת את הבידוד, culturing, וצעדי הבידול לתוך מסגרת 1 ?...

הולכה עצבית יעילה במערכת העצבים המרכזית היונקת (CNS) דורשת מעטפת המיאלין של אקסונים על ידי oligodendrocytes. במהלך פיתוח, oligodendrocytes להתעורר מתוך מאגר של ובתאים oligodendrocyte (OPCs) כי הם חשבו להגר מאזורי חדרית של המוח קדמי בפיתוח עצבי צינור 1. לאחר OPCs הגירה להתמיין oligodendrocytes בוגרת, myelinating כי לא רק להקל התפשטות הדחף יעיל, אלא גם לספק אקסונים עם תמיכה trophic 2. המבוגר CNS שומרת אוכלוסיה שופעת של OPCs כי הם מפוזרים בכל רחבי החומר האפור-לבן המהוות כ 5-8% מכלל התאים 3. בעקבות עלבון demyelinating, OPCs להגר באתר של פציעה, להתרבות, ולבדל להחליף נדני המיאלין אבודים או פגומים על אקסונים חשופים. עם זאת, בכמה הגדרות מחלה / פציעה, תהליך זה נמצא להיות יעיל או יכול להיכשל 4 לחלוטין. בשעה שdemyelination כרוני הוא חשב להוסיף את נטל המחלה, oligodendrogenesis ויצירת מיאלין יעיל עשוי להקל תסמינים 5. בהתאם לכך, כבר היה עניין ללמוד OPCs במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים הניסיונות על oligodendrogenesis. תובנה השלבים השונים של בידול oligodendrocyte כבר מתאפשר על ידי זיהוי של סמני תאים ספציפיים הבמה. עצמית חידוש ובתאים מוקדם מוגדרים על ידי הביטוי שלהם של אלפא הקולטן לגורם הצמיחה נגזר טסיות (PDGFRα), עצביים / גליה אנטיגן 2 (NG2) ו A2B5 6 - 8. כפי OPCs ליזום תכנית הבידול שלהם לסגת מחזור התא, הם downregulate ביטוי של סמנים אלה ולהתחיל לבטא חלבונים מעידים premyelinating oligodendrocytes כולל המחזורי-נוקלאוטיד 3&#39;-phosphodiesterase (CNPase) ו O4. לבסוף, הבידול שלהם לתוך oligodendroc בוגרת יותרytes מתאפיין ביטוי של חלבונים הקשורים המיאלין, כולל גליקופרוטאין הקשורים המיאלין (הפצ&quot;ר), חלבון proteolipid (PLP), ואת חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). MBP הוא חלבון קרום היקפי תאיים מרכיב עיקרי של מעטפת המיאלין. עכברים שחסר MBP לפתח פנוטיפ חמור שבו myelination CNS הוא ירד מוביל משמעותי רעידות, עוויתות 9,10 מוות מוקדם. תפקיד חשוב זה של MBP ב myelination הוביל שימוש בו כסמן של בידול oligodendrocyte היא במבחנת in vivo 11. כימות של MBP יכולה להיות מושגת באמצעות מתודולוגיות שונות. RT-PCR וניתוח כתם המערבי לאפשר כימות של רמות MBP תחת משטרי טיפול שונים. Immunocytochemistry היא שיטה איכותית נפוצה שיכולה גם להיות כמותית כאשר גישות מיקרוסקופיה מבוסס מצלמה משמשות. למרות שמערכות אלה מהימנות יסודיש המחקר של בידול oligodendrocyte, הם כל החסרונות שלהם כי להגביל את השימוש שלהם ב ההקרנה סמים. ראשית, כמות OPCs העיקרית הדרושים RT-PCR וניתוח כתם המערבי מפחית את מספר משתנים שיכולים להיבחן בו זמנית. בעוד דרישת תא immunocytochemistry היא הרבה יותר נמוכה, זמן ניכר חייב להיות מוקדש כל ניסוי אם כימות היא מטרה. תמונות רבות חייבות להיות בשבי ואז לכמת כדי להקל על הניתוח הניסיון. אזהרות אלה הופכים מכשולים חשובים לשקול ללימודים הדורשים הערכת קצב העברת נתונים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה אשר מנצל היבטים בסיסיים משני immunocytochemistry ומתודולוגיות כתם המערבי כימות המיאלין, תוך הפחתה משמעותית של שניהם את מספר התאים הדרושים זמן להשלמת ניתוח כמותי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:691px;">Dissection Materials</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Polystyrene Petri Dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>0857512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light Dissection Microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SM2-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Dissociation Materials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>Dissociation Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Enzymatic Dissociation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-030-CV</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">A2B5 Column Purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-A2B5 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-864</td>
			<td>Bead Bound A2B5 Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic Selection Columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-Cl</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-030-CV</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDGF-AA</td>
			<td>PeproTech Inc</td>
			<td>100-13A</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Hybri-Max 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodothyronine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td>45 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clemastine fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0445-100MG</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quetiapine hemifumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Q3638-10MG</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>60 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrecine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7505</td>
			<td>16 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td>40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">d-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apo-Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace Elements B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-022-Cl</td>
			<td>1 x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>1 x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1 x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>1 x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Black Visiplate with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-605</td>
			<td>Tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Immunocytochemistry and Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100-13A</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78787</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-MBP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SMI-99P</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit polyclonal anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>SC-7210</td>
			<td>1:200 Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit polyclonal anti-Olig2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse 680RD</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-rabbit 800CW</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1:000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Licor Odyssey Clx Infared Imaging System</td>
			<td>Licor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat oligodendrocyte progenitor cultures and quantification of oligodendrogenesis using dual-infrared fluorescence scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

OPCs A2B5 החיובי מבודדים באמצעות בחירת תא חיובית באמצעות מערכת הפרדת עמודה מגנטית. לפני תחילת ההליך בבידוד, המוח כולו יוסר גורי חולדה כי הם בין P5 ו P7. ברגע שהמוח כולו מנותק בהצלחה מהגולגולת, נורות המוח קטנת ההרחה מוסרות באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning at JoVE.com

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

משלוח<em&gt; In vivo</em&gt; חריפה לסירוגין היפוקסיה בילוד מכרסמים לתא תרבויות עצבית אב נגזרות אזור ראש Subventricular

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...