Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

اكسون تخطي هي تقنية علاجية واعدة لعلاج DMD. على حد سواء في التجارب المختبرية والتجارب المجراة أظهرت أن تعدد اكسون تخطي ممكنا. هنا، وتناقش استخدام نموذج الكلب CXMD. أولا، تم تصميم AONs باستخدام-جنوب شرقي الإنقاذ البرامج وESEfinder لاستهداف الإكسونات الدستروفين 6 - 8. تم استخدام الكيمياء 2&#39;OMePS AON لCXMD ترنسفكأيشن بالخلايا العضلية الجذعية واختير العمود الفقري الكيمياء morpholino AON للتجارب في الجسم الحي. vPMOs هي أكثر كفاءة من أبطأ قليلا معدلة ولكن نظرا لسمية أعلى من أنها ليست مناسبة لحقن النظامية. أجريت استخراج الحمض النووي الريبي، RT-PCR، وتسلسل [كدنا على myoblasts CXMD. كانت الكلاب حقن مع كوكتيل PMO متدرج سريريا لتقييم التحسن في الأعراض السريرية. بعد الكلاب والموت الرحيم إنسانية، وتم أخذ عينات العضلات وتتوق إلى البرد باجتزاء. نصف العمر للبروتين الدستروفين الناجم عن وويعتقد مكتب الإحصاءات الوطنية إلى أن ما يقرب من 1-2 أشهر. واستخدمت الكلاب الشباب البالغين في هذه الدراسة، على الرغم من أن هذه التجارب يمكن القيام به مع الكلاب حديثي الولادة وكبار السن من الكلاب (&gt; 5 سنوات من العمر). استخدمت أقسام العضلات مستعدة لتقييم التشريح المرضي وتقييم الإنقاذ بروتين الدستروفين من خلال النشاف الغربي والمناعية 48. من المهم للتأكد من أن حجم محلول PMO هو الصحيح قبل الحقن. والفشل في القيام بذلك لها آثار كبيرة على النتائج. خلال الحقن في العضل، مطلوب ما يكفي من الضغط لإدخال الألياف العضلية. رصد صحة الكلب والتفتيش للموقع الجراحة مهمة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. لمراقبة صحة الحيوان، ويجب أن يتم تنفيذ اختبارات الدم الأسبوعية وزنها. بعد euthanization للحيوان وإعداد عينات العضلات، خطوة حاسمة لضمان حساسية في الكشف عن بروتين الدستروفين هو استخدام كل من هلام تريس، خلات وطريقة النشاف شبه الجافةأثناء إجراء النشاف الغربي. كما هو مبين في نتائج تمثيلية، myoblasts تعامل مع Ex6A، Ex6B، Ex8A، وكوكتيل (التي تحتوي على Ex6A، Ex6B، Ex8A، وEx8B) المنتجة في الإطار منتجات DMD. منذ Ex8B لم تسفر عن منتجات اكسون تخطي، لم يستخدم في اللاحقة في التجارب المجراة. أظهر كدنا] تسلسل أن الإكسونات 6-9 تخطي حدث ومناعية مع DYS-2 تلطيخ أظهرت استعادة تعبير الدستروفين في عينات المعالجة. وأظهرت الكلاب تعامل AON-زيادة كبيرة في الألياف الدستروفين إيجابي. هذا يدل على أن الإكسونات 6-8 ويجري تخطي وتم إنتاج بروتين تقصير. زيادة كمية الألياف الدستروفين إيجابي عندما تم استخدام مزيج من AONs وكان يتناسب مع AON الجرعة. Immunoblots أظهرت زيادة التعبير الدستروفين في الكلاب المعالجة morpholino النظامية. كان الهيكل العظمي والعضلات مستويات مختلفة من الألياف الدستروفين. ومع ذلك، المعالجة morpholino أنسجة القلب أظهرت قليلاتحسن في التعبير الدستروفين. منذ الدستروفين له وزن جزيئي عال (427 كيلو دالتون)، والكشف عن كميات قليلة من الدستروفين يمكن أن يكون صعبا. للحصول على أفضل النتائج، واستخدمت هلام تريس، خلات وطريقة نقل شبه الجافة. سعادة تلطيخ أظهرت تحسن التشريح المرضي في الكلاب المعالجة morpholino. الألياف الأنوية مركزيا (CNFs) هي علامة على العضلات صحية وتمثل دورات من ضمور العضلات وتجديد. وأظهرت تعامل Morpholino الكلاب CXMD انخفاضا في نسبة CNFs بالمقارنة مع الكلاب CXMD غير المعالجة. وكشف الدرجات السريرية تحسنا في الأعراض، مثل زيادة المشي والقدرة على التوالي، في معاملة الحيوانات morpholino. ويعتقد أن صلابة العضلات لتعكس ضمور العضلات، وبالتالي، تم تضمينه في نظام الدرجات 59. تم تقييم صلابة من الفخذ (هند الأطراف الاصطناعية) العضلات. ومع ذلك، فقد استبعدنا العضلات سارتوريوس الجمجمة لأنها تميل إلى إظهار تضخم بدلا من ضمور في CXMD. تظهر الكلاب تعاملإد انخفاض درجات التصنيف، وكان أسرع الأوقات في اختبار تشغيل 15 م. تحسين مرات على اختبار 15 م تدل على تحسين وظيفة العضلات 40. وتشير ارتفاع معدلات الدرجات الإجمالية سوء الحالة الصحية وزيادة ضمور العضلات. في حين أن هذه النتائج واعدة ومتعددة اكسون تخطي لا يزال يعرض العديد من التحديات التي سوف تحتاج إلى التغلب عليها قبل أن التقنية تطبيق السريرية. نسيج القلب لا يزال يعرض انخفاض الإقبال على AONs، على الأرجح بسبب الفرق في الاتجار الخلوي بين أنسجة القلب والهيكل العظمي. وقد لوحظ عدم وجود آثار سامة في الحيوانات تحت نظم الجرعة الحالية. ومع ذلك، هناك المزيد من العمل الذي يتعين القيام به لتقييم السمية طويلة الأجل قبل استخدام المولوتوف AON يمكن أن تتحرك إلى التجارب السريرية. ومن الصعب الحصول على موافقة للأدوية كوكتيل AON لأن الهيئات التنظيمية تحدد كل تسلسل AON كدواء فريدة من نوعها. وهذا يعني أن كل تسلسل في كوكتيل سوف تحتاج لفحصها بشكل فردي لسافيتذ، الأمر الذي يتطلب المزيد من الوقت والمزيد من المال. حاجز آخر لاستخدام تخطي متعددة اكسون في عملية إعداد سريرية كمية كبيرة من منتجات البروتين وسيطة أنتجت مع وظائف غير معروفة. هذه البروتينات يمكن أن تؤدي إلى لا يمكن التنبؤ بها آثار جانبية، اعتمادا على طفرة الفردية 22. بالإضافة إلى ذلك، أنماط الطفرات المتاحة ضمن نماذج الكلب التصنع الحالية محدودة. هناك عدد قليل من الطفرات التي تحدث بشكل طبيعي، وليس كل الطفرات مفيدة لدراسة متعددة اكسون الطفر. نموذج خنزير التصنع وعود ليكون بديلا جيدا للمستقبل DMD اكسون تخطي الدراسات 33 و 34. نماذج الكلب DMD لها بعض المزايا على نماذج DMD أخرى. كونها أكبر نموذج حيواني، والتصنيف السريري والتصوير بالرنين المغناطيسي ممكنة، والسماح لتحليل أكثر تفصيلا. منذ الكلاب هي الحيوانات الكبيرة بل هي أيضا أكثر ملاءمة للدراسات علم السموم وتمثل أكثر عن كثب الأمراض التي تصيب البشر بالمقارنة مع نموذج الفأر. كلب ميكون odels أيضا نائب العضو المنتدب للتسلسل الجينات التي هي أكثر مماثلة على البشر 23، 34، 45. وعلى الرغم من صعوبة من الناحية الفنية، يمكن للنهج تخطي متعددة اكسون تستفيد في النهاية&gt; 90٪ من المرضى DMD 24. وهذا يجعل من بديل أفضل بكثير لتخطي-اكسون واحد، كما هو واكسون واحد الطفر لا ينطبق إلا على مجموعة فرعية صغيرة من المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، سوف متعددة اكسون تخطي تمكننا من تحديد أنماط الحذف التي تعمل على تحسين وظائف بروتينات الدستروفين تقصير. على سبيل المثال، حذف DMD الإكسونات 45-55 يرتبط بأعراض خفيفة بشكل استثنائي أو الأفراد غير متناظرة 14،19،60-63. وقد تم بالفعل أظهرت 55 في نموذج الفأر من DMD مع حذف اكسون 52 (mdx52) باستخدام الحقن النظامية من vPMOs 22،26 - لتخطي متعددة اكسون الإكسونات 45. ومع ذلك، أثبتت استخدام vPMOs كوكتيل في أشكال أخرى من الضمور العضلي، مثلكما فوكوياما ضمور العضلات الخلقي (FCMD). ويتسبب FCMD من محاصرة اكسون، الذي هو سبب الشاذة الربط مرنا من قبل الإدراج retrotransposon. وقد ثبت vPMOs لانقاذ نمط الربط في كل نموذج الفأر FCMD وفي خطوط الخلايا البشرية 64. ان الجيل القادم من AON كيمياء واظهار أعلى كفاءة وأقل سمية تسهيل الترجمة الفعلية لنهج تخطي متعددة اكسون في التطبيق السريري. بالإضافة إلى ذلك، من المحتمل أن يطبق تخطي متعددة اكسون إلى اضطرابات وراثية أخرى، مثل dysferlinopathies 24، 65.

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو أحد أمراض العضلات المتنحية المرتبطة X يتميز بضعف العضلات التدريجي، وصف لأول مرة من قبل الدكتور غيوم-بنيامين أماند دوشين (بولوني) 1. DMD هو مرض وراثي شائع يؤثر على حوالي 1 في 3500 الفتيان في جميع أنحاء العالم، مع ما يقرب من 20،000 الأطفال المتضررين يولدون كل عام 2،3. تأخر النمو الحركي وتعتبر اضطرابات المشية في مرحلة الطفولة المبكرة 4، تليها الاعتماد على كرسي متحرك في حوالي سن المراهقة المبكرة. تحدث الوفاة عادة تتراوح أعمارهم بين 20 و 30 بسبب الجهاز التنفسي أو القلب الفشل 5-8. لا يوجد حاليا أي علاج لDMD. العلاج مع السكرية يمكن أن يبطئ تطور ضمور العضلات إلى حد ما ولكن يترافق مع آثار جانبية كبيرة، بما في ذلك السمنة وداء السكري 2،7،8. DMD ينجم عن طفرات في جين الدستروفين (DMD)، مما يؤدي إلى فقدان protei الدستروفين وظيفيةن. DMD هو جين كبير للغاية مع أكثر من 2 مليون زوج قاعدة و 79 الإكسونات 9،10. الحذف، هراء، والازدواجية الطفرات المؤدية إلى خارج الإطار الطفرات هي السبب الأكثر شيوعا من النمط الظاهري نائب العضو المنتدب. ويطلق على 55 &quot;النقاط الساخنة طفرة&quot; لأن معظم المرضى الذين لديهم طفرات الحذف داخل هذه الأجزاء من الجينات، مما يؤدي إلى الدستروفين غير وظيفية في المرضى الذين يعانون DMD 3،9،11-16 - المناطق الإكسونات 3-9 والإكسونات 45. وظائف الدستروفين داخل مجمع بروتين سكري الدستروفين (نادي دبي للجواهر)، التي لها دور كبير في استقرار غشاء العضلات. وN- وC-ترميني هي المجالات الأكثر أهمية بالنسبة للوظيفة، في حين يلعب المجال قضيب المركزي 3،9،17 دور أقل أهمية. مراعاة النمط الظاهري معتدل مصحوب بيكر ضمور العضلات (BMD)، والذي ينتج في الغالب من الطفرات في الإطار داخل الجين DMD، ألهم تطبيق اكسون تخطي لعلاج DMD. المرضى BMD لديها تقصير، ولكن functionaل، بروتين الدستروفين أن يحافظ على حد سواء ترميني 3،6،18. اكسون الطفر، من الناحية النظرية، يمكن استعادة إطار القراءة، مما أدى إلى البروتينات الدستروفين الوظيفية تقصير، ولكن، مماثلة لتلك التي ظهرت في BMD 3،19. وقد تم اختبار أنواع متعددة من أليغنوكليوتيد] العقاقير (AONs) في التجارب السريرية، بما في ذلك phosphorothioates ميثليته 2&#39;O (2&#39;OMePS) والأوليغومرات phosphorodiamidate morpholino (أبطأ قليلا). تخطي الإكسونات 51 و 53 استخدام هذه AONs وقد تم فحص وعلى الرغم من النتائج واعدة، واكسون واحد تخطي تطبيق محدودة، كما هو طفرة محددة 3، 19، 20،21، 22-26. تبقى الأسئلة أيضا بشأن استقرار ينتج عن ذلك من البروتينات الدستروفين تقصير ينتج من واحد اكسون تخطي 22،23. بالإضافة إلى ذلك، يحتاج بعض المرضى أكثر من اكسون واحد ليتم تخطي من أجل استعادة إطار القراءة 3. في حين أن أكثر صعوبة من الناحية الفنية، متعدد اكسون الطفر هو أسلوب واحديمكن أن تعالج هذه المشاكل 3،19. وقد سبق أن أثبتت متعددة اكسون الطفر في الكلب التصنع وخطوط الخلايا البشرية في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام mdx52 الماوس والكلاب العاشر مرتبطة ضمور العضلات (CXMD) نماذج الكلب لفي الدراسات المجراة 22، 24-27. الكلاب العاشر مرتبطة ضمور العضلات اليابان (CXMD J) استخدمت البيجل هنا، كإطار قراءة CXMD J يمكن الحفاظ عليه من خلال تخطي متعددة اكسون الإكسونات 6 و 8، أو الإكسونات إضافية (على سبيل المثال، الإكسونات 3-9) (الشكل 1). يشارك CXMD أساس بيغل-نفس النمط طفرة كنموذج الذهبي المسترد ضمور العضلات (GRMD)، ولكن البيجل هي أصغر حجما وأرخص للحفاظ نظرا لحجم أجسامهم، مما يوفر نموذجا مفيدا للDMD 28،29. الكلاب CXMD تحاكي بشكل وثيق النمط الظاهري نائب العضو المنتدب للالبشري من النماذج الحيوانية الصغيرة، مثل القوارض، وهي أكثر موثوقية لتقييم السمية 3،22،30،31 </sتصل&gt; (الشكل 2). الكلاب CXMD عرض التدريجي تسوس العضلات، واضطرابات المشية، ومشاكل في القلب والجهاز التنفسي مماثلة لتلك التي ظهرت في إعلان الدوحة الوزاري. مقارنة مع تخطي-اكسون واحد، متعدد اكسون تخطي ينطبق على نسبة أكبر بكثير من المرضى. ومن بين أنواع الطفرات الثلاث الأكثر شيوعا (الحذف، هراء، والتكرار)، 80 - يمكن علاج 98٪ من المرضى من خلال متعددة اكسون تخطي 14،32،33، في حين أن 45٪ من جميع المرضى DMD يمكن أن تستفيد من الإكسونات تخطي تحديدا 45 - 55 3،19،22،34. مع تطور morpholinos تعديل، تحسنت كفاءة من الكوكتيلات AON في تسهيل تخطي اكسون. أرجينين الغنية بمعدل أبطأ قليلا الببتيد مترافق-اختراق الخلية (PPMOs)، والجسم الحي morpholinos (vPMOs) هي كيمياء AON التي حسنت بشكل ملحوظ القدرة على اختراق الخلية والاستقرار 3،35-38. لا يزال هناك قلق حول طويل الأجل AON سمية. ومع ذلك، تقدما كبيراتم صنعه. التعديلات التي أدخلت على المواد الكيميائية morpholinos يقلل إلى حد كبير بعيدا عن الهدف الآثار ووأفادت الدراسات ما قبل السريرية ليس لها آثار سامة كبيرة 3،22،39،40. ويتمثل أحد التحديات المتبقية لتخطي متعددة اكسون هو الشرط الحالي لكل AON واحد ليتم اختبار السمية وحده، باعتباره دواء واحد، بدلا من معا في كوكتيل 3،19،22،41،42. في دراسات DMD تشمل كلا من واحد ومتعدد اكسون تخطي تستهدف قلب، كان هناك تحسن طفيف في أنسجة القلب التصنع. ويعتقد أن فعالية morpholinos في قلب لتكون منخفضة بسبب ضعف القدرة على اختراق الخلية. وتحسنت PPMOs الببتيد مترافق قدرة AONs على اختراق خلايا القلب، وزيادة كمية البروتين الدستروفين وظيفية انقاذ في قلب 3،19،38. هنا، وتناقش نهجنا كوكتيل AON مطولا، بما في ذلك تصميم تسلسل AON باستخدام برنامج ESEfinder 43. Protocويرد أيضا عملية شريان الحياة للتجارب الكلب مع تخطي متعددة اكسون. واستخدمت CXMD J البيجل لالإكسونات 6 و 8 تجارب تخطي. متعددة اكسون تخطي في نموذج الكلب CXMD يظهر نتائج واعدة، ولكن تبقى التحديات التي يجب التغلب عليها قبل أن تكون قابلة للتطبيق سريريا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو واحد من الأمراض الوراثية القاتلة الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم، التي تسببها طفرات في جين الدستروفين (DMD). اكسون تخطي يستخدم الحمض النووي القصير / مثل RNA الجزيئات تسمى أليغنوكليوتيد] العقاقير (AONs) أن استعادة إطار القراءة وإنتاج البروتينات أقصر ولكن وظيفية. ومع ذلك، اكسون العلاج تخطي يواجه عقبتين رئيسيتين: محدودة التطبيق (تصل إلى 13٪ فقط من المرضى يمكن معالجتها بعقار AON واحدة)، وظيفة غير واثقين من البروتينات مبتورة. وتم تناول هذه القضايا مع نهج كوكتيل AON. بينما حوالي 70٪ من المرضى DMD يمكن علاجها عن طريق تخطي اكسون واحد (كل الإكسونات معا)، قد يكون بمقدورها معالجة أكثر من 90٪ من المرضى DMD إذا اكسون متعددة تخطي باستخدام العقاقير العقاقير كوكتيل يمكن أن تتحقق. تم استخدام الكلاب X المرتبطة ضمور العضلات (CXMD) نموذج الكلب، الذي النمط الظاهري هو أكثر مماثلة للمرضى DMD البشري، لاختبار effic النظاميةACY وسلامة تخطي متعددة اكسون الإكسونات 6 و 8. نموذج الكلب وCXMD المرافئ طفرة الموقع لصق في إنترون 6، مما يؤدي إلى عدم وجود اكسون 7 في مرنا الدستروفين. لاستعادة إطار القراءة في CXMD يتطلب تخطي متعددة اكسون الإكسونات 6 و 8؛ وبالتالي، CXMD هو نموذج حيواني متوسطة الحجم جيدة لاختبار فعالية وسلامة تخطي متعددة اكسون. في الدراسة الحالية، وقد تم تصميم مزيج من morpholinos العقاقير التي تستهدف اكسون 6 و 8 اكسون واستعادة تعبير الدستروفين في العضلات والهيكل العظمي في جميع أجزاء الجسم. يتم عرض طرق ترنسفكأيشن / حقن oligos كوكتيل وتقييم فعالية وسلامة تخطي متعددة اكسون في نموذج الكلب CXMD.

في التجارب المختبرية و transfected Myoblasts مع مختلف الظروف العلاج 2&#39;OMePS من أجل مقارنة فعالية كل AON. وقد أجريت العلاجات AON واحدة مع 600 نيوتن متر من كل Ex6A، Ex6B، Ex8A، أو Ex8B، فضلا عن معالجة كوكتيل مع 600 نيوتن متر لكل من جميع متواليات AON 4. تم جمع عينات الحمض النووي الريبي بعد أربعة أيام ترنسفكأيشن. بعد RT-PCR، تم تشغيل عينات لكل معاملة على هلام جنبا إلى جنب مع عينات غير المعالجة (NT). عصابات أعلى على هلام تمثل خارج الإطار منتجات DMD. وينظر إلى هذه العصابات في NT، Ex8A، وEx8B تعامل myoblasts. أظهرت Ex6A، Ex6B، Ex8A، وmyoblasts المعالجة كوكتيل المنتجات في الإطار. أظهر كوكتيل وEx6A / B 100٪ منتجات في الإطار، في حين أظهرت Ex8A 30٪ فقط في الإطار منتجات (الشكل 7). لتأكيد تخطي اكسون وترميمفي إطار القراءة، تم إجراء كدنا] تسلسل. وأشارت النتائج إلى أن الإكسونات 6-9 قد تم بالفعل تخطي (الشكل 7). أظهرت المناعية أن الكلاب تعامل AON قد زادت الألياف الدستروفين إيجابي مقارنة عينات NT (الشكل 8). في التجارب فيفو لمقارنة كفاءة مختلف الظروف العلاج AON، والكلاب CXMD - تم حقن (0.5 5 سنوات من العمر) مرة واحدة مع 1.2 ملغ Ex6A أو مزيج من Ex6A، Ex6B، وEx8A على مختلف جرعات. بعد أسبوعين من الحقن، وقد تم جمع عينات العضلات وملطخة DYS-1 للمقارنة بين عدد من الألياف الدستروفين إيجابي. أظهرت جميع العينات المعالجة كوكتيل زيادة التعبير الدستروفين مقارنة عينات NT. ارتفعت الألياف الدستروفين الإيجابي مع AON الجرعة (الشكل 9). النظام التاليةحقن جيم، كانت ملطخة البرية من نوع (WT)، NT، وعينات العضلات CXMD المعالجة كوكتيل مع DYS-1 (الشكل 10). المعالجة كوكتيل الكلاب CXMD أظهرت زيادة التعبير الدستروفين بالمقارنة مع الكلاب NT CXMD، سواء في التصوير المقطعي وعينات عضلة القلب. ومع ذلك، أظهرت المعالجة AON العضلات والهيكل العظمي (CT) تعبير أعلى بكثير من الدستروفين مقارنة عضلة القلب المعالجة. وأدى طخة مناعية مقارنة WT، NT، ومختلف morpholino العضلات المعالجة كوكتيل إلى نفس النتيجة. كان هناك أيضا مجموعة واسعة من التعبير الدستروفين في عينات العضلات والهيكل العظمي المعالجة (الشكل 10). كشفت الهيماتوكسيلين ويوزين (سعادة) تلطيخ أن تعامل CXMD وأظهرت الكلاب تحسين التشريح المرضي، مع انخفاض ملحوظ في الألياف مركزيا الأنوية (كنف) بالمقارنة مع الكلاب NT CXMD (الشكل 11). وهذا يدل على أن هناك المزيد من انحطاط / تجديد تحدث في الكلب NT، علامة على أمراض التصنع العضلات. بالإضافة إلى ذلك، كانت الكلاب تعامل بشكل أسرعتشغيل مرات وتحسين الدرجات على مقياس الدرجات السريرية. وأظهرت معاملة الكلاب CXMD عشرات أفضل من الكلاب NT CXMD في جميع الفئات (الشكل 12). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> الشكل 1. الطفرة نمط من الكلب CXMD وexons متماثلة 6 - 8 استراتيجيات تخطي باستخدام كوكتيل العقاقير الكلاب CXMD لديهم طفرة نقطة في اكسون 6 مما يؤدي إلى فقدان اكسون 7 في التصنع الكلب مرنا. وهذا يؤدي إلى مرنا يجري خارج الإطار وإنتاج بروتين الدستروفين تضيع. تم تصميم تسلسل AON قصيرة لربط اكسون 6 و 8، والذي ينتج في مرنا الربط تخطي فعال الإكسونات 6 - 8. الشريط الرمادي في الكلاب المعالجة كوكتيل AON يمثل تسلسل AON قصيرة. اكسون 9 بترميز مجال المفصلي وأحيانا تقسم بشكل عفوي خارجا مع AONs ضد اكسون 6 و 8. الناتجة رموز مرنا لالدستروفين البروتينات التي هي أقصر ولكن وظيفةآل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> ويبين الشكل 2. الأعراض السريرية الرئيسية للحيوان البالغ من العمر 1-العاشر مرتبطة الناب ضمور العضلات (CXMD). ويبلغ من العمر 1-النوع البري بيغل والكلب CXMD. وعادة ما تكون لوحظ اشتراك الداني، أطرافه، والعضلات الزمنية من 2 أشهر من العمر. انكماش مشترك وتحول من الحوض وعلني من 4 أشهر من العمر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> الشكل 3. التخدير العام للكلب. أ) Intramusculيتم تنفيذ الحقن AR والخزعات العضلية تحت التخدير العام مع isoflurane. ب) عقد الحيوان لحقن النظامية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> الشكل 4. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) من النوع البري، غير المعاملة CXMD، وتعامل CXMD. فحوصات الرنين المغناطيسي للأطرافهم هند في 3 أشهر و 5 أشهر في WT و NT CXMD الكلاب. وتظهر صورتان عينة من يعامل هند CXMD أطرافهم الرنين المغناطيسي ما قبل (1 قبل أسبوع من الحقنة الأولى) وبعد حقن AON. كان يعامل 2703MA أسبوعيا 7X مع 200 ملغ / كغ morpholinos كوكتيل. كان يعامل 2001MA مع 5X رابعا الحقن الأسبوعية من 120 ملغ / كغ morpholinos كوكتيل. كانت السيطرة والكلاب معاملة متساوية في العمر. الكلاب تعامل تظهر انخفض إشارات T2. الصور هي اداب<html> تيد بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> ويحدد الشكل 5. العضلات إجراء خزعة للكلب. أ) والطرف السفلي للخزعة العضلات. ب) بمساعدة ملقط، ويقام الطرف السفلي. C) تتعرض العضلات CT. يستخدم تقنية خزعة مفتوحة للحصول على عينات العضلات من مواقع حقن. وتستخدم المواضيع لعقد عينات الخزعة. عينات D) العضلات على الصمغ الكثيراء بعد تشريح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; ويرد الشكل 6. أسلوب نقل نصف الجافة. وتمثيل طريقة نقل شبه الجافة لالنشاف الغربية. وضعت ثلاث ورقات غارقة في المخزن الأنود تتركز في أسفل السالب. مكدسة 3 ورقات غارقة في المخزن الأنود على رأس هذا. يتم استيعابه ورقة ميغابايت PVDF في الميثانول ثم عازلة الأنود قبل أن يوضع على رأس 6 أوراق. هلام، التي كانت غارقة في المخزن الكاثود، وضعت بلطف على ورقة PVDF. وأخيرا، وضعت 3 أوراق غارقة في المخزن الكاثود على أعلى من هلام. تم تعيين الموجب على القمة. لمدة 1 ساعة، 400 مللي أمبير تشغيل من خلال النظام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> الرقم 7. اكسون الطفر في CXMD Myoblasts. </stرونغ&gt; و transfected myoblasts CXMD مع Ex6A، Ex6B، Ex8A، أو Ex8B وحده، أو مزيج من كل أربعة. تم استخدام ما مجموعه 600 نانومتر لتسلسل الفردية وللكوكتيل تم استخدام 600 نيوتن متر من كل تسلسل. أ) 2&#39;OMePS العلاج في myoblasts الكلب CXMD. Ex6A، Ex6B، والعينات المعالجة كوكتيل تظهر العصابات القوية في الموقف المتوقع من في إطار النصوص-اكسون تخطي. يظهر Ex8A فرقة المتوسطة، Ex8B يدل على الفرقة ضعف، وNT لا تظهر الفرقة في الموقف في الإطار. ب) التسلسل [كدنا من Ex6A وحده، بعد 4 أيام ترنسفكأيشن. يتم تكييفها الصور بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> الرقم 8. زيادة Dystropو transfected هين التعبير في ميثليته 2&#39;O-Phosphorothioate (2&#39;OMePS) Transfected CXMD Myoblasts. myoblasts CXMD مع Ex6A وحدها أو مع 2&#39;OMePS كوكتيل. وتظهر DYS-2 (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ. تتم مقارنة myoblasts المعالجة إلى البرية من نوع (WT) وmyoblasts غير المعالجة (NT). يتم تكييفها الصور بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40. بار = 50 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> تم حقن الرقم 9. الإنقاذ التعبير الدستروفين مع العضل حقن Morpholinos في CXMD الكلاب. اما Ex6A وحدها أو مزيج من Ex6A، Ex6B، وEx8A في العضلات CT الكلاب CXMD. الدستروفين (DSY-1) تلطيخ من النوع البري(WT)، غير المعالجة (NT)، وترد تعامل الكلاب CXMD. تم علاج الكلاب إما مع 1.2 ملغ Ex6A وحدها أو 1.2 ملغ كوكتيل. يتم تكييفها الصور بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40. بار = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> الرقم 10. زيادة الدستروفين التعبير بعد كوكتيل الجهازية Morpholino العلاج في CXMD الكلاب. الدستروفين (DYS-1) استخدم تلطيخ لمقارنة التعبير الدستروفين في البرية من نوع (WT) (مراقبة إيجابية)، غير المعالجة (NT) (المراقبة السلبية)، والكلاب CXMD تعامل مع 120 ملغ / كغ morpholino كوكتيل (40 ملغ / كغ من كل AON). كوكتيل morpholino يرد Ex6A، Ex6B، وEx8A. تم حقن الكلاب عن طريق الوريد 5 مرات نحنekly مع هذا الكوكتيل. أ) مقارنة التعبير الدستروفين في عظام الساق الجمجمة (CT) عضلات WT، NT، والكلاب المعالجة. B) مقارنة التعبير الدستروفين في أنسجة القلب بين NT وmorpholino الكلاب المعالجة كوكتيل. ويرد C) طخة مناعية لالدستروفين مع desmin كما تحكم التحميل لWT، NT، وmorpholino الكلاب المعالجة كوكتيل. وتظهر عضلات التالية للكلاب المعالجة: ثلاثية الرؤوس العضدية (السل)، العضلة ذات الرأسين العضدية (BB)، والحجاب الحاجز (DIA)، المريء (ESO)، CT، المقرب (ADD)، باسطة إبهام اليد (مؤسسة كهرباء لبنان)، الماضغة (MAS)، والقلب. يتم تكييفها الصور بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40. بار = 200 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> الشكل11. تحسين التشريح المرضي في CXMD الكلاب المعالجة لمدة 7 أسابيع مع 240 ملغ / كغ Morpholino كوكتيل. تم حقن الكلاب CXMD تتراوح بين عام ونصف العام لمدة خمس سنوات عن طريق الوريد مع 240 ملغ / كغ morpholino كوكتيل (Ex6A، Ex6B، وEx8A) مرة واحدة في الأسبوع لمدة 7 أسابيع. بعد أربعة عشر يوما من الحقن الماضي، اتخذت عضلات المريء وفعل الهيماتوكسيلين ويوزين (سعادة) تلطيخ. سعادة تلطيخ للعضلات المريء من غير المعالجة (NT) وmorpholino (المعالجة) الكلاب CXMD تعامل كوكتيل (40X عدسة الهدف). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> وتمت مقارنة الرقم 12. عشرات تحسين على الدرجات السريرية و 15 مترا مدة العرض بعد الكلاب تعامل Morpholino-Morpholino العلاج. إلى غير المعاملة (NT) littermateالصورة. أشرطة الخطأ في الرسم البياني تشير SEM. أ) تم حساب مجموع النقاط في امتحان التصنيف السريري قبل وبعد العلاج وتمت مقارنة الحيوانات تعامل مع تتزاحم NT. ب) مقارنة بين 15 مترا مرات تشغيل الكلاب المعالجة وNT. C) على غرار باء؛ ومع ذلك، تم استخدام الكلاب الأصغر سنا. يتم تكييفها الصور بإذن من يوكوتا وآخرون. (حقوق الطبع والنشر 2009، جون وايلي وأولاده) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> العقاقير قليل النوكليوتيد </td><td> النوكليوتيدات تسلسل </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قليل النوكليوتيد العقاقير التصميم.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

متعددة اكسون تخطي عن طريق أليغنوكليوتيد] كوكتيل العقاقير في ضمور العضلات المرتبطة X الناب

اكسون تخطي حاليا خيارا علاجيا الواعدة لضمور العضلات دوشين (DMD). على توسيع إمكانية تطبيق للمرضى DMD ولتحسين الاستقرار / وظيفة من الناتج البروتينات الدستروفين اقتطاع، تم وضع متعددة اكسون تخطي النهج باستخدام أليغنوكليوتيد] العقاقير كوكتيل وأثبتنا الإنقاذ الدستروفين النظامية في نموذج الكلب.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

فيفو الناب في العضلات وظيفة الفحص

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

بروتوكول الفحص على أساس خلية للتنبؤ النذير من الجنف مجهول السبب عن طريق الخلوي عازل الطيفي

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الضمور العضلي المرضى: كفاءة خالية من التكامل إعادة برمجة الخلايا المستمدة البول

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

نمذجة العضلي الضمور 1 في خلايا C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

تقييم إدراج إكسون الناجمين عن طريق لصق تبديل النوكليوتيد العقاقير في SMA المريض الليفية

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

تجلط الشريان السباتي الكلاب المستحثة بكلوريد الحديد: نموذج حيوان كبيرة لإصابة الأوعية الدموية

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

قياسات للوظيفة الحركية وغيرها من المعالم النتائج السريرية في الأطفال حركيا مع ضمور العضلات دوشين

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

توصيف إكسون تخطي الكفاءة في DMD عينات المرضى في التجارب السريرية من Oligonucleotides Antisense

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

استخدام خزعة كيميائية لتقييم جودة الكسب غير المشروع

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...