Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

Exon skipping er en lovende terapeutisk teknik til behandling af DMD. Både in vitro og in vivo forsøg har vist, at multi-exon skipping er mulig. Her er anvendelsen af ​​CXMD hundemodel diskuteret. Først blev AONs designet Brug af Rescue-ESE og ESEfinder programmer til at målrette dystrofin exon 6 - 8. 2&#39;OMePS AON kemi blev brugt til CXMD myoblast transfektion og morpholino AON backbone kemi blev valgt til in vivo eksperimenter. vPMOs er mere effektive end umodificerede projektstyringskontorer men på grund af deres højere toksicitet, de er ikke egnede til systemiske injektioner. RNA-ekstraktion, RT-PCR, og cDNA-sekventering blev udført på de CXMD myoblaster. Hunde injiceret med PMO cocktail var klinisk gradueret til at vurdere enhver forbedring i kliniske symptomer. Efter hundene blev humant aflivet, blev muskel udtaget og forberedt til cryo-sektionering. Halveringstiden af ​​dystrophinprotein induceret af AONS menes at være ca. 1 - 2 ud måneder. Unge voksne hunde blev anvendt i denne undersøgelse, selvom der kan gøres disse forsøg med neonatale hunde og ældre hunde (&gt; 5 år). Tilberedte muskel snit blev anvendt til at evaluere histopatologi og vurdere dystrophinprotein redning gennem Western blotting og immunhistokemi 48. Det er vigtigt at sikre, at volumenet af PMO opløsningen er korrekt, før injektioner; ikke at gøre dette, vil få væsentlig indvirkning på resultaterne. Under intramuskulære injektioner, er tilstrækkeligt tryk, der kræves for at komme ind muskelfibrene. Overvågning af hundens sundhed og inspektion af operationsstedet er vigtige for fejlfinding. For at overvåge dyrs sundhed, bør der udføres ugentlige blodprøver og vejning. Efter euthanization af dyret og forberedelse af muskel prøver, et afgørende skridt for at sikre følsomhed i detektering dystrophinprotein er at bruge både Tris-acetat gel og halvtør blotting metodeunder Western blotting-procedure. Som vist i de repræsentative resultater, myoblaster behandlet med Ex6A, Ex6B, Ex8A, og cocktail (indeholdende Ex6A, Ex6B, Ex8A, og Ex8B) fremstillet i ramme DMD produkter. Da Ex8B produceret ingen exon-sprunget over produkter, blev det ikke brugt i efterfølgende in vivo forsøg. cDNA-sekventering viste, at exonerne 6-9 skipping opstod og immuncytokemi med DYS-2-farvning viste restaureret dystrofinekspression i behandlede prøver. AON-behandlede hunde udviste en signifikant stigning i dystrofin-positive fibre. Dette indikerer, at exonerne 6 - 8 blev blive sprunget over og et afkortet protein blev produceret. Mængden af ​​dystrofin-positive fibre øges, når anvendtes en cocktail af AONs og var proportional med AON dosering. Immunoblots viste øget dystrofinekspression i systemiske morpholino-behandlede hunde. Skeletal muscle havde variable niveauer af dystrofin fibre; imidlertid viste lidt morpholino-behandlede hjertevævforbedring i dystrofinekspression. Da dystrofin har en høj molekylvægt (427 kDa), kan påvisning af små mængder dystrofin være vanskelig. For de bedste resultater, blev Tris-acetat-gel og halvtørre overførselsmetode anvendes. HE farvning viste forbedret histopatologi i morpholino-behandlede hunde. Centralt-kerneholdige fibre (CNFs) er et tegn på usund muskler og repræsenterer cykler af muskel degeneration og regeneration. Morpholino-behandlede CXMD hunde viste et fald i procentdelen af ​​CNFs i sammenligning med ikke-behandlede CXMD hunde. Klinisk grading afslørede en forbedring af symptomer, såsom øget gang og løb evne, i morpholino-behandlede dyr. Hårdheden af muskler menes at afspejle muskelatrofi, blev således indgår i vurderingen skema 59. Hårdheden af ​​låret (hind-lemmer) muskler blev evalueret; Men vi udelukkede craniale Sartorius muskler fordi de har tendens til at udvise hypertrofi stedet atrofi i CXMD. Behandlede hunde visered lavere klassificering scoringer og havde hurtigere tider på 15 m kører test. Forbedrede gange på 15 m testen indikerer forbedret muskelfunktion 40. Højere samlet klassificering score indikerer dårligt helbred og øget muskel atrofi. Mens disse resultater er lovende, multi-exon skipping præsenterer stadig mange udfordringer, der skal overvindes, før teknikken har klinisk anvendelighed. Cardiac væv viser stadig reduceret optagelse af AONs, sandsynligvis på grund af forskellen i cellulær handel mellem hjerte- og knoglevæv. Ingen toksiske virkninger er blevet observeret hos dyr under de nuværende doseringsregimer; dog brug for mere arbejde, der skal gøres for at vurdere langtidstoksicitet før brugen af ​​AON cocktails kan flytte til kliniske forsøg. Det er svært at få godkendelse til AON cocktail narkotika, fordi reguleringsorganer definere hver AON sekvens som et unikt lægemiddel. Dette betyder, at hver sekvens i en cocktail skulle være individuelt testet for safety, hvilket kræver mere tid og flere penge. En anden hindring for anvendelsen af ​​multi-exon skipping i et klinisk miljø er en stor mængde mellemprodukter proteinprodukter fremstillet med ukendte funktioner. Disse proteiner kan potentielt føre til uforudsigelige bivirkninger, afhængigt af den enkelte mutation 22. Derudover mutation mønstre tilgængelige inden for de nuværende dystrofiske hund modeller er begrænset. Der er få naturligt forekommende mutationer, og ikke alle mutationer er nyttige til at studere multi-exon skipping. Den dystrofisk grisemodel lover at være et godt alternativ for fremtiden DMD exon skipping studier 33, 34. DMD hund modeller har nogle fordele frem for andre DMD modeller. At være en større dyremodel, klinisk sortering og MR er mulige, giver mulighed for en mere detaljeret analyse. Da hunde er store dyr er de også mere egnet til toksikologiske undersøgelser og tættere repræsenterer den humane sygdom i forhold til musemodel. Hund models har også DMD gensekvenser, der er mere ligner mennesker 23, 34, 45. Selvom teknisk udfordrende, kunne multi-exon skipping tilgang i sidste ende gavne&gt; 90% af DMD patienter 24. Dette gør det en langt bedre alternativ til single-exon skipping, som single-exon skipping gælder kun en lille delmængde af patienterne. Desuden vil flere exon springe muligt for os at vælge de sletning mønstre, der optimerer funktionaliteten af ​​de forkortede dystrofin proteiner. For eksempel, sletning af DMD exon 45-55 er forbundet med usædvanligt milde symptomer eller asymptomatisk individer 14,19,60-63. Den multi-exon skipping af exon 45 - 55 er allerede blevet påvist i en musemodel for DMD med en exon 52 deletion (mdx52) under anvendelse af systemiske injektioner af vPMOs 22,26. Anvendelsen af ​​cocktail vPMOs er også blevet påvist i andre former for muskeldystrofi, såsomsom Fukuyama medfødt muskelsvind (FCMD). FCMD skyldes exonindfangning, hvori aberrerende mRNA splejsning er forårsaget af retrotransposon insertion. vPMOs er blevet vist at redde splejsningsmønster i både en FCMD musemodel og i humane cellelinier 64. Næste generation AON kemier udviser højere effektivitet og lavere toksicitet ville lette en effektiv oversættelse af multi-exon skipping tilgang til klinisk anvendelse. Derudover kunne multi-exon skipping potentielt anvendes på andre genetiske sygdomme, såsom dysferlinopathies 24, 65.

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en X-linked recessive muskel lidelse karakteriseret ved fremadskridende muskelsvaghed, først beskrevet af Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD er en almindelig genetisk sygdom, der påvirker omkring 1 i 3500 drenge i hele verden, med cirka 20.000 berørte børn født hvert år 2,3. Motoriske udvikling er forsinket, og gangforstyrrelser ses i den tidlige barndom 4, efterfulgt af afhængighed kørestol ved om de tidlige teenageår. Døden opstår typisk i alderen mellem 20 og 30 på grund af respiratorisk eller hjertesvigt 5-8. Der er i øjeblikket ingen helbredelse for DMD. Behandling med glukokortikoider kan bremse udviklingen af muskeldegeneration til en vis grad, men er forbundet med betydelige bivirkninger, herunder fedme og diabetes mellitus 2,7,8. DMD skyldes mutationer i dystrofin (DMD) genet, hvilket fører til et tab af funktionel dystrofin Protein. DMD er en meget stor gen med over 2 millioner basepar og 79 exons 9,10. Sletning, nonsense, og dobbeltarbejde mutationer, der fører til out-of-frame mutationer er den mest almindelige årsag til DMD fænotype. Regionerne exonerne 3 - 9 og exon 45 - 55 betegnes &quot;mutation hotspots&quot; som de fleste patienter har deletionsmutationer inden for disse dele af genet, hvilket fører til ikke-funktionelle dystrofin i DMD patienter 3,9,11-16. Dystrofin funktioner i dystrofin-glycoprotein-kompleks (DGC), som har en afgørende rolle i stabilisering muskel membran. Den N- og C-termini er de vigtigste områder for funktion, mens den centrale stang domænet spiller en mindre vigtig rolle 3,9,17. Overholdelsen af en mild fænotype forbundet med Becker muskeldystrofi (BMD), som for det meste skyldes i-frame mutationer i DMD-genet, inspireret anvendelse af exon springe til behandling af DMD. BMD patienter har en forkortet, men functional, dystrophinprotein, der fastholder begge termini 3,6,18. Exon skipping, i teorien, kan gendanne læserammen, hvilket resulterer i forkortede-men-funktionelle dystrofin proteiner ligner dem, der ses i BMD 3,19. Flere typer af antisense oligonukleotider (AONs) er blevet afprøvet i kliniske forsøg, herunder 2&#39;O-methylerede phosphorthioater (2&#39;OMePS) og phosphordiamidat morpholino oligomerer (PMOS). Skipping exon 51 og 53 ved hjælp af disse AONs er blevet undersøgt, og mens resultaterne er lovende, er single-exon skipping begrænset anvendelighed, da det er mutationsspecifikke 3, 19, 20,21, 22-26. Spørgsmål også fortsat om stabiliteten af de resulterende forkortede dystrofin proteiner fremstillet af single-exon springe 22,23. Derudover nogle patienter kræver mere end en enkelt exon, der skal springes over for at genoprette læserammen 3. Mens teknisk vanskeligere, multi-exon skipping er en metode, derkunne løse disse problemer 3,19. Multi-exon skipping er tidligere blevet påvist i dystrofisk hund og humane cellelinier in vitro. Derudover har mdx52 mus og hunde X-bundet muskeldystrofi (CXMD) Hund modeller blevet anvendt til undersøgelser in vivo 22, 24-27. Canine X-bundet muskeldystrofi Japan (CXMD J) beagler blev anvendt her, som læserammen for CXMD J kan genoprettes ved multi-exon skipping af exon 6 og 8, eller yderligere exoner (f.eks exonerne 3 - 9) (fig 1). Beagle-baserede CXMD deler den samme mutation mønster som Golden Retriever muskelsvind (GRMD) model, men beagles er mindre og billigere at vedligeholde på grund af deres krop størrelse, hvilket giver en nyttig model for DMD 28,29. CXMD hunde mere nøje efterligner den menneskelige DMD fænotype end mindre dyremodeller, ligesom gnaver, og er mere pålidelige for toksikologiske vurderinger 3,22,30,31 </sop&gt; (Figur 2). CXMD hunde vise progressiv muskel forfald, gangforstyrrelser, og hjerte- og åndedrætsproblemer ligner dem, der ses i DMD. Sammenlignet med single-exon skipping, multi-exon skipping er gældende for en meget større andel af patienterne. Blandt de tre mest almindelige mutation typer (deletioner, nonsens, og dobbeltarbejde), 80 - kunne 98% af patienterne behandles gennem multi-exon skipping 14,32,33, mens 45% af alle DMD patienter kunne drage fordel af specifikt springer exons 45 - 55 3,19,22,34. Med udviklingen af ​​modificerede morpholinos, har effektiviteten af ​​AON cocktails på at lette exon springe forbedret. Arginin-rige celle-gennemtrængende peptid-konjugeret projektstyringskontorer (PPMOs), og vivo-morpholinoer (vPMOs) er AON kemier, der har væsentligt forbedrede celle-gennemtrængende evne og stabilitet 3,35-38. Bekymringer forblive om langsigtet AON toksicitet; dog betydelige fremskridtDer er gjort. Kemiske foretaget morpholinoer ændringer i høj grad falde off-target effekter og prækliniske studier har rapporteret om signifikante toksiske virkninger 3,22,39,40. En tilbageværende udfordring for multi-exon skipping er det nuværende krav for hver enkelt AON skal testes for toksicitet alene, som et enkelt lægemiddel, i stedet for sammen som en cocktail 3,19,22,41,42. I DMD undersøgelser med både single og multi-exon Skipping målrettet til hjertet, har der været lidt forbedring i dystrofisk hjerte væv. Effekten af ​​morpholinos i hjertet menes at være lav på grund af dårlig celle-gennemtrængende evne. Peptid-konjugerede PPMOs har forbedret evne AONs at trænge ind hjerteceller, forøgelse af mængden af funktionelle dystrophinprotein reddet i hjertet 3,19,38. Her er vores AON cocktail tilgang drøftet indgående, herunder design af AON sekvenser ved hjælp ESEfinder software 43. Protocoler til hund eksperimenter med multi-exon skipping er også beskrevet. CXMD J beagler blev anvendt til exon 6 og 8 springer eksperimenter. Multi-exon springe i CXMD hund model viser lovende resultater, men udfordringer, der skal overvindes, før de er klinisk relevant.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en af de mest almindelige dødelige genetiske sygdomme verden over, som skyldes mutationer i dystrofin (DMD) genet. Exon skipping beskæftiger kort DNA / RNA-lignende molekyler kaldet antisense oligonukleotider (AONs), der genopretter læsning ramme og producerer kortere, men funktionelle proteiner. Imidlertid exon skipping terapi står over for to store forhindringer: begrænset anvendelighed (op til kun 13% af patienterne kan behandles med en enkelt AON lægemiddel) og usikker funktion af trunkerede proteiner. Disse spørgsmål blev behandlet med en cocktail AON tilgang. Mens ca. 70% af DMD patienter kan behandles ved en enkelt exon skipping (alle exoner kombineret), kunne man potentiel behandling mere end 90% af DMD patienter, hvis multiple exon skipping hjælp cocktail antisenselægemidler kan realiseres. Hunde X-bundet muskeldystrofi (CXMD) hundemodel, hvis fænotype er mere ligner humane DMD patienter, blev anvendt til at teste den systemiske effekACY og sikkerheden af multi-exon skipping af exon 6 og 8. CXMD hundemodel huser et splejsningssted mutation i intron 6, som fører til en mangel på exon 7 i dystrofin mRNA. For at gendanne læseramme CXMD kræver multi-exon skipping af exon 6 og 8; Derfor CXMD er en god mellemstor dyremodel til test af effekten og sikkerheden af ​​multi-exon skipping. I den aktuelle undersøgelse blev en cocktail af antisense morpholinos målrettet exon 6 og exon 8 konstrueret og det gendannede dystrofinekspression i kroppen hele skeletmuskulatur. Metoder til transfektion / injektion af cocktail oligoer og evaluering af effekten og sikkerheden af ​​multi-exon skipping i CXMD hund model præsenteres.

In Vitro Eksperimenter Myoblaster blev transficeret med forskellige 2&#39;OMePS behandling betingelser for at sammenligne effektiviteten af ​​hver AON. Single Aon behandlinger med 600 nM af hver af Ex6A, Ex6B, Ex8A eller Ex8B blev gjort, samt en cocktail behandling med 600 nM af hver af alle 4 Aon sekvenser. RNA-prøver blev opsamlet fire dage efter transfektion. Efter RT-PCR, blev prøver fra hvert behandlingsregime kørt på en gel sammen med ikke-behandlede (NT) prøver. Bands højere på gelen repræsentere out-of-frame DMD produkter; disse bånd blev set i NT, Ex8A, og Ex8B behandlede myoblaster. Ex6A, Ex6B, Ex8A, og cocktail-behandlede myoblaster viste i-frame produkter. Cocktail og Ex6A / B viste 100% i-ramme produkter, mens Ex8A viste kun 30% i-ramme produkter (figur 7). For at bekræfte exon skipping og restaurering aflæserammen, blev cDNA sekventering udført; Resultaterne indikerede, at exonerne 6-9 havde faktisk blevet sprunget over (figur 7). Immunhistokemi viste at AON-behandlede hunde havde øget dystrofin-positive fibre sammenlignet med NT prøver (figur 8). In vivo forsøg For at sammenligne effektiviteten af ​​forskellige AON behandling betingelser, CXMD hunde - blev (0,5 5 år gamle) injiceres en gang med 1,2 mg Ex6A eller en cocktail af Ex6A, Ex6B, og Ex8A ved forskellige doseringer. To uger efter injektionen blev muskel udtaget og farvet med DYS-1 til at sammenligne antallet af dystrofin-positive fibre. Alle cocktail-behandlede prøver viste øget dystrofinekspression sammenlignet med NT prøver. Dystrofin-positive fibre steg med AON dosering (figur 9). Efter systemetic injektion blev vildtype (WT), NT, og cocktail-behandlede CXMD muskelprøver farvet med DYS-1 (figur 10). Cocktail-behandlede CXMD hunde viste øget dystrofinekspression sammenlignet med NT CXMD hunde, både i CT og hjertemuskelceller prøver. Men AON-behandlede skeletmuskel (CT) viste, meget højere ekspression af dystrofin sammenlignet med behandlede hjertemusklen. En immunoblot sammenligner WT, NT, og forskellige morpholino cocktail-behandlede muskler førte til den samme konklusion. Der var også et stort udvalg af dystrofin-ekspression i de behandlede skeletmuskel prøver (figur 10). Hematoxylin og eosin (HE) -farvning afslørede, at behandlet CXMD hunde viste forbedret histopatologi, med et signifikant fald i centralt kerneholdige fibre (CNF) i sammenligning med NT CXMD hunde (Figur 11). Dette indikerer at der er mere degeneration / regeneration forekommer i NT hund, et tegn på dystrofisk muskel patologi. Derudover behandlede hunde havde hurtigerekører tider og forbedrede resultater på den kliniske karakterskala. Behandlede CXMD hunde viste bedre score end NT CXMD hunde i alle kategorier (Figur 12). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figur 1. Mutation Mønster af CXMD Hund og Exon 6 -. 8 Skipping strategier via en antisense Cocktail CXMD hunde har et punkt mutation i exon 6, der fører til et tab af exon 7 i dystrofisk hund mRNA. Dette resulterer i mRNA bliver ud-af-ramme og dystrophinprotein produktionen går tabt. Korte Aon sekvenser er designet til at binde til exon 6 og 8, hvilket resulterer i mRNA-splejsning effektivt springe exon 6 - 8. Den grå bjælke i Aon cocktail-behandlede hunde betegner korte Aon sekvenser. Exon 9 koder for et hængsel domæne og er undertiden spontant splejses ud med AONs mod exon 6 og 8. De resulterende mRNA koder for dystrofin proteiner, der er kortere, men funktional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figur 2. Større kliniske symptomer på en 1-årig Canine X-bundet Muskelsvindfonden (CXMD) Animal. A 1-årig vildtype beagle og en CXMD hund vises. typisk observeres Inddragelse af proksimale og legeme, og tidsmæssige muskler fra 2 måneders alderen. Fælles kontraktur og en forskydning af bækken er åbenlys fra 4 måneders alderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figur 3. Generel anæstesi for en hund. A) Intramuscular injektioner og muskel biopsier udføres under generel anæstesi med isofluran. B) Holding af dyret for systemiske injektioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figur 4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) af Wild-type, ikke-behandlede CXMD, og behandlet CXMD. MRI scanninger af bagbenet på 3 måneder og 5 måneder i WT og NT CXMD hunde. To sample billeder af behandlede CXMD bagben MRIs præ- (1 uge før den første injektion) og post-injektion af AON vises. 2703MA behandledes 7x ugentligt med 200 mg / kg cocktail morpholinoer. 2001MA blev behandlet med 5x ugentlige IV injektion af 120 mg / kg cocktail morpholinoer. Kontrol og behandlede hunde var alders-matchede. Behandlede hunde viser nedsat T2 signaler. Billeder er ADAP<html> ted med tilladelse fra Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figur 5. muskelbiopsi Procedure for en hund. A) En lavere lemmer fastsættes for muskel biopsi. B) Ved hjælp af pincet, er den nedre lemmer afholdt. C) CT musklen er udsat for. Åben biopsi teknik anvendes til at opnå muskel prøver af injicerede steder. Tråde bruges til at holde biopsiprøver. D) Muscle prøver på tragacanthgummi efter dissektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6. Semi-tør overførselsmetode. En repræsentation af halvtørre overførselsmetode til Western blotting præsenteres. Tre papirer lægges i blød i koncentreret anode buffer er fastlagt på den negative terminal; 3 papirer gennemvædet i anodebuffer er stablet oven på dette. Den Mb PVDF papiret er gennemvædet i methanol og derefter anode buffer inden bliver lagt oven på de 6 papirer. Gelen, der er blevet dyppet i katode buffer, lægges forsigtigt over PVDF papir. Endelig er 3 papirer gennemvædet med katode puffer lagt oven på gelen. Den positive terminal er sat på toppen. For 1 time, 400 mA køres gennem systemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figur 7. Exon Skipping i CXMD Myoblaster. </stRong&gt; CXMD myoblaster blev transficeret med Ex6A, Ex6B, Ex8A eller Ex8B alene, eller en cocktail af alle fire. I alt 600 nM blev anvendt til de enkelte sekvenser og for den cocktail blev anvendt 600 nM af hver sekvens. A) 2&#39;OMePS behandling i CXMD hund myoblaster. Ex6A, Ex6B, og cocktail-behandlede prøver viser stærke bands på den forventede position i-frame exon-sprunget udskrifter. Ex8A viser et mellemliggende bånd, Ex8B viser en svag band, og NT ikke viser et bånd ved den i ramme position. B) cDNA-sekventering fra Ex6A alene, 4 dage efter transfektion. Billeder er tilpasset med tilladelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figur 8. Øget Dystrophin Expression i 2&#39;O-methylerede Phosphorthioat (2&#39;OMePS) transficerede CXMD Myoblaster. CXMD myoblaster blev transficeret med Ex6A alene eller med cocktail 2&#39;OMePS. DYS-2 (rød) og DAPI (blå) farvning er vist. De behandlede myoblaster er sammenlignet med vildtype (WT) og ikke-behandlede (NT) myoblaster. Billeder er tilpasset med tilladelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figur 9. Redning af dystrofinekspression med intramuskulære injektioner af morpholinos i CXMD Dogs. Enten Ex6A alene eller en cocktail af Ex6A, Ex6B, og Ex8A blev injiceret i CT muskler CXMD hunde. Dystrofin (DSY-1) farvning af vildtype(WT), ubehandlet (NT), og behandlet CXMD hunde er vist. Hunde blev enten behandlet med 1,2 mg Ex6A alene eller 1,2 mg cocktail. Billeder er tilpasset med tilladelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figur 10. Forøget dystrofinekspression efter systemisk Cocktail Morpholino Behandling i CXMD Dogs. Dystrofin (DYS-1) farvning blev anvendt til at sammenligne dystrofinekspression i vildtype (WT) (positiv kontrol), ubehandlet (NT) (negativ kontrol), og CXMD hunde behandlet med 120 mg / kg morpholino cocktail (40 mg / kg af hver AON). Morpholino cocktail indeholdt Ex6A, Ex6B, og Ex8A. Hunde blev injiceret intravenøst ​​5 gange viekly med denne cocktail. A) En sammenligning af dystrofin ekspression i kraniel tibial (CT) musklerne i WT, NT, og behandlede hunde. B) En sammenligning af dystrofinekspression i hjertet væv mellem NT og morpholino cocktail-behandlede hunde. C) Immunblot for dystrofin med desmin som en loading kontrol er vist for WT, NT, og morpholino cocktail-behandlede hunde. Følgende muskler er vist for behandlede hunde: triceps brachii (TB), biceps brachii (BB), membran (DIA), spiserør (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), masseter (MAS), og hjerte. Billeder er tilpasset med tilladelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figur11. Forbedret Histopatologi i CXMD hunde behandlet i 7 uger med 240 mg / kg Morpholino Cocktail. CXMD hunde spænder fra et halvt år til fem år blev injiceret intravenøst ​​med 240 mg / kg morpholino cocktail (Ex6A, Ex6B, og Ex8A) én gang uge i 7 uger. Fjorten dage efter den sidste injektion blev spiserør muskler taget og hematoxylin og eosin (HE) farvning blev gjort. HE farvning af spiserøret muskler fra ikke-behandlede (NT) og morpholino cocktail-behandlede (behandlet) CXMD hunde (40X objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figur 12. Forbedrede Scores på Klinisk Grading og 15 m Running Time Efter Morpholino behandling. Morpholino-behandlede hunde blev sammenlignet med ikke-behandlede (NT) kulds. Fejl barer i grafen angiver SEM. A) Samlet score på den kliniske sortering eksamen blev beregnet før og efter behandling, og behandlede dyr blev sammenlignet med NT søskende. B) En sammenligning af 15 m køretider af behandlede og NT hunde. C) Svarende til B; imidlertid var yngre hunde anvendt. Billeder er tilpasset med tilladelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> antisense-oligonukleotid </td><td> nucleotidsekvens </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabel 1. antisense-oligonucleotid Design.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-exon Skipping Brug Cocktail antisenseoligonukleotider i Canine X-bundet Muskelsvindfonden

Exon skipping er i øjeblikket en mest lovende behandlingsmulighed for Duchennes muskeldystrofi (DMD). For at udvide anvendeligheden for DMD patienter og optimere stabiliteten / funktion af de resulterende trunkerede dystrofin proteiner, blev en multi-exon springe tilgang med cocktail antisense oligonukleotider udviklet og vi viste systemisk dystrofin redning i en hund model.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Cell-baserede Assay Protokol for den prognostiske Forudsigelse af idiopatisk Skoliose Brug Cellular Dielektriske spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generation af induceret pluripotente stamceller fra Muskelsvindfonden Patienter: Effektiv Integration-fri Omprogrammering af urin afledte celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modeling myotonic dystrofi 1 i C2C12 myoblastceller

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Evaluering af Exon integration induceret af splejse skifte Antisense oligonukleotider i SMA patienten fibroblaster

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Ferrichloridopløsning-induceret Canine carotis arterie trombose: En stor dyr Model af vaskulære skade

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Målinger af motorik og andre kliniske resultater parametre i specialistbehand børn med Duchennes muskeldystrofi

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Karakteristik Exon Spring effektivitet i DMD patientprøver i kliniske forsøg med antisense oligonukleotider

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...