Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

Le saut d&#39;exon thérapeutique est une technique prometteuse pour le traitement de la DMD. In vitro et in vivo ont montré que le multi-saut d&#39; exon est réalisable. Ici, l&#39;utilisation du modèle de chien CXMD est discuté. Tout d&#39; abord, AON ont été conçus à l&#39; aide des programmes de sauvetage-ESE et ESEfinder pour cibler les exons de la dystrophine 6 - 8. La composition chimique 2&#39;OMePS AON a été utilisée pour la transfection et CXMD myoblastes le squelette chimique morpholino AON a été choisi pour les expériences in vivo. vPMOs sont plus efficaces que les PMO non modifiés, mais en raison de leur toxicité plus élevée, ils ne sont pas appropriés pour les injections systémiques. extraction de l&#39;ARN, une RT-PCR et séquençage d&#39;ADNc ont été réalisées sur les myoblastes CXMD. Chiens injectés avec le cocktail PMO étaient cliniquement graduée pour évaluer toute amélioration des symptômes cliniques. Après les chiens ont été euthanasiés sans cruauté, des échantillons de muscles ont été prélevés et préparés pour cryo-tronçonnage. La demi-vie de la protéine dystrophine induite par unNRO est censé être environ 1 - 2 mois. chiens jeunes adultes ont été utilisés dans cette étude, bien que ces expériences peuvent être faites avec des chiens néonatales et les chiens âgés (&gt; 5 ans). Sections musculaires préparées ont été utilisés pour évaluer l&#39; histopathologie et évaluer protéine dystrophine sauvetage par Western blot et immunohistochimie 48. Il est important de veiller à ce que le volume de la solution CPM est correcte avant les injections; à défaut de le faire aura des effets significatifs sur les résultats. Pendant les injections intramusculaires, une pression suffisante est nécessaire pour entrer dans les fibres musculaires. Surveillance de la santé et l&#39;inspection du site de la chirurgie chien sont importants pour le dépannage. Pour surveiller la santé des animaux, des tests sanguins hebdomadaires et de pesage doivent être effectués. Après l&#39;euthanasie de l&#39;animal et la préparation des échantillons de muscle, une étape essentielle pour assurer la sensibilité dans la détection de la protéine dystrophine est d&#39;utiliser à la fois le gel Tris-acétate et méthode de transfert semi-seclors de la procédure par Western Blot. Comme on le voit dans les résultats représentatifs myoblastes traités avec Ex6A, Ex6B, Ex8A et le cocktail (contenant Ex6A, Ex6B, Ex8A et Ex8B) réalisé en cadre produits DMD. Depuis Ex8B produit aucun produit exon-sautée, il n&#39;a pas été utilisé dans la suite des expériences in vivo. séquençage d&#39;ADNc a montré que les exons 6-9 saut a eu lieu et immunocytochimie avec DYS-2 coloration a montré restauré l&#39;expression de la dystrophine dans les échantillons traités. AON chiens traités ont montré une augmentation significative des fibres dystrophine positives. Cela indique que les exons 6-8 ont été ignorés et une protéine raccourcie a été produit. La quantité de fibres dystrophine positives augmenté quand un cocktail d&#39;AON a été utilisé et est proportionnelle à la dose AON. Immunotransferts a montré une expression de la dystrophine a augmenté chez les chiens systémiques morpholino traités. Le muscle squelettique a des niveaux variables de fibres dystrophine; Cependant, le tissu cardiaque morpholino traité a montré peul&#39;amélioration de l&#39;expression de la dystrophine. Etant donné que la dystrophine présente un poids moléculaire élevé (427 kDa), la détection de faibles quantités de la dystrophine peut être difficile. Pour les meilleurs résultats, gel Tris-acétate et la méthode de transfert semi-sec ont été utilisés. HE coloration a montré l&#39;amélioration de l&#39;histopathologie chez les chiens morpholino-traités. fibres centre-nucléés (CNFS) sont un signe de muscle malsain et représentent des cycles de dégénérescence musculaire et la régénération. chiens CXMD morpholino-traités ont montré une diminution du pourcentage de CNF par rapport aux chiens CXMD non traités. classement clinique a révélé une amélioration des symptômes, tels que l&#39;augmentation marche et la capacité en cours d&#39;exécution, chez les animaux morpholino traités. La dureté des muscles est censé refléter l&#39; atrophie musculaire, donc, il a été inclus dans le système de classement 59. La dureté de la cuisse (membres postérieurs) muscles a été évaluée; cependant, nous avons exclu les muscles sartorius crâniens parce qu&#39;ils ont tendance à présenter une hypertrophie plutôt que dans l&#39;atrophie CXMD. Les chiens traités montrented scores de classement inférieurs et avait fois plus rapide sur le test de roulage de 15 m. Amélioration fois sur le test de 15 m sont indicatifs de l&#39; amélioration de la fonction musculaire 40. scores de classement globaux plus élevés indiquent une mauvaise santé et une augmentation de l&#39;atrophie musculaire. Bien que ces résultats sont prometteurs, multi-exon skipping présente encore de nombreux défis qui devront être surmontés avant que la technique a une applicabilité clinique. tissu cardiaque affiche toujours l&#39;absorption réduite de AON, probablement en raison de la différence dans le trafic cellulaire entre le tissu cardiaque et squelettique. Aucun effet toxique n&#39;a été observé chez les animaux de moins de posologies en cours; Cependant, plus de travail doit être fait pour évaluer la toxicité à long terme avant l&#39;utilisation de cocktails AON peut se déplacer à des essais cliniques. Il est difficile d&#39;obtenir l&#39;approbation de médicaments AON cocktail parce que les organismes de réglementation définissent chaque séquence AON comme un médicament unique. Cela signifie que chaque séquence dans un cocktail devra être testé individuellement pour safety, ce qui nécessite plus de temps et plus d&#39;argent. Un autre obstacle à l&#39;utilisation de la multi-saut d&#39;exon dans un environnement clinique est une grande quantité de produits protéiques produits intermédiaires avec des fonctions inconnues. Ces protéines peuvent potentiellement conduire à des effets secondaires imprévisibles, en fonction de la mutation individuelle 22. En outre, les profils de mutation disponibles dans les modèles actuels de chien dystrophiques sont limitées. Il existe peu de mutations naturelles, et non pas toutes les mutations sont utiles pour étudier plusieurs saut d&#39;exon. Le modèle dystrophique de porc promet d&#39;être une bonne alternative pour l&#39; avenir DMD saut d&#39; exon études 33, 34. Les modèles de chiens DMD présentent certains avantages par rapport aux autres modèles de DMD. Être un plus grand modèle animal, le classement clinique et l&#39;IRM sont possibles, ce qui permet une analyse plus détaillée. Puisque les chiens sont de grands animaux, ils sont également plus adapté pour les études toxicologiques et représentent plus étroitement la maladie humaine par rapport au modèle de la souris. Chien modèles ont aussi des séquences de gènes DMD qui sont plus semblables aux humains 23, 34, 45. Bien que techniquement difficile, l&#39;approche de saut multi-exon pourrait finalement bénéficier&gt; 90% des patients atteints de DMD 24. Cela en fait une bien meilleure alternative à un seul saut d&#39;exon, comme un seul saut d&#39;exon est applicable uniquement à un petit sous-ensemble de patients. En outre, multi-exon skipping nous permettra de sélectionner les motifs de suppression qui optimisent la fonctionnalité des protéines de la dystrophine raccourcie. Par exemple, la suppression de la DMD exons 45 - 55 est associée à des symptômes exceptionnellement doux ou individus asymptomatiques 14,19,60-63. Le saut multi-exon des exons 45 - 55 a déjà été démontré dans un modèle de souris de la DMD avec un exon 52 délétion (mdx52) en utilisant des injections systémiques de vPMOs 22,26. L&#39;utilisation de cocktails vPMOs a également été démontrée dans d&#39;autres formes de dystrophie musculaire,comme Fukuyama dystrophie musculaire congénitale (FCMD). FCMD est provoquée par le piégeage d&#39;exon, dans lequel l&#39;épissage aberrant est provoquée par l&#39;insertion de rétrotransposon. vPMOs ont été montrés pour délivrer le motif d&#39;épissage dans les deux un modèle de souris FCMD et dans des lignées cellulaires humaines 64. La nouvelle génération AON chimies présentant une efficacité élevée et une toxicité plus faible faciliterait la traduction effective de l&#39;approche de saut multi-exon dans l&#39;application clinique. En outre, multi-saut d&#39; exon pourrait être appliquée à d&#39; autres troubles génétiques, tels que la dysferlinopathies 24, 65.

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire récessive liée à l&#39; X caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, d&#39; abord décrit par le Dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD est une maladie génétique fréquente qui touche environ 1 à 3.500 garçons à travers le monde, avec environ 20 000 enfants touchés nés chaque année 2,3. Le développement moteur est retardée et troubles de la marche sont vus dans la petite enfance 4, suivie par fauteuil roulant dépendance à peu près au début de l&#39; adolescence. La mort survient généralement entre les âges de 20 et 30 en raison d&#39; une insuffisance respiratoire ou cardiaque 5-8. Il n&#39;y a actuellement aucun remède pour DMD. Le traitement par glucocorticoïdes peut ralentir la progression de la dégénérescence musculaire à un certain degré , mais est associé à des effets secondaires importants, y compris l&#39; obésité et le diabète sucré 2,7,8. DMD résulte de mutations dans le dystrophine Duchenne (DMD) , le gène, ce qui conduit à une perte de dystrophine fonctionnelle protein. DMD est un très grand gène avec plus de 2 millions de paires de bases et 79 exons 9,10. Délétion, non-sens, et de duplication des mutations conduisant à des mutations hors-cadre sont la cause la plus commune du phénotype DMD. Les régions des exons 3 - 9 exons et 45 - 55 sont appelés &quot;points chauds de mutation» , comme la plupart des patients présentent des mutations de deletion dans ces parties du gène, ce qui conduit à la dystrophine non fonctionnelle chez les patients souffrant de DMD 3,9,11-16. les fonctions de la dystrophine dans le complexe dystrophine-glycoprotéine (DGC), qui a un rôle important dans la stabilisation de la membrane musculaire. N- et C-terminales sont les domaines les plus importants pour la fonction, alors que le domaine de la tige centrale joue un rôle moins important 3,9,17. Le respect d&#39;un phénotype doux associé à dystrophie musculaire de Becker (BMD), qui résulte principalement de mutations en cadre dans le gène DMD, inspiré de l&#39;application de saut d&#39; exon pour le traitement de la DMD. patients BMD ont un raccourci, mais functional, protéine dystrophine qui maintient deux extrémités 3,6,18. Le saut d&#39; exon, en théorie, peut restaurer le cadre de lecture, ce qui entraîne la dystrophine protéines fonctionnelles raccourcies mais-similaires à ceux observés dans la DMO 3,19. Plusieurs types d&#39;oligonucléotides antisens (AON) ont été testés dans des essais cliniques, y compris phosphorothioates 2&#39;O-méthylés (2&#39;OMePS) et oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO). Exons Sauter 51 et 53 à l&#39; aide de ces AON ont été examinés et alors que les résultats sont prometteurs, un seul saut d&#39; exon a limité l&#39; applicabilité, comme il est de 3, 19, 20,21, 22-26 mutation spécifique. Des questions subsistent également quant à la stabilité des protéines de dystrophine raccourcie résultant produites à partir de simple saut d&#39; exon 22,23. En outre, certains patients ont besoin de plus d&#39;un seul exon à être ignorées afin de rétablir le cadre de lecture 3. Bien que techniquement plus difficile, multi-saut d&#39;exon est une méthode quipourrait remédier à ces problèmes 3,19. Multi-saut d&#39; exon a déjà été démontrée chez le chien dystrophique et des lignées de cellules humaines in vitro. En outre, mdx52 dystrophie musculaire (CXMD) modèles de chien liées à l&#39;X de la souris et canines ont été utilisées pour les études in vivo 22, 24-27. Canine dystrophie musculaire liée à l&#39; X Japon (CXMD J) beagles ont été utilisés ici, comme le cadre de lecture de CXMD J peut être restauré par le multi-exon skipping des exons 6 et 8, ou exons supplémentaires (par exemple, les exons 3-9) (Figure 1). CXMD à base de Beagle partage le même type de mutation que le modèle Golden Retriever dystrophie musculaire (DRG), mais beagles sont plus petits et moins coûteux à entretenir en raison de la taille de leur corps, fournissant ainsi un modèle utile pour DMD 28,29. Chiens CXMD imitent plus étroitement le phénotype DMD humain que les modèles animaux plus petits, comme les rongeurs, et sont plus fiables pour les évaluations toxicologiques 3,22,30,31 </sup&gt; (figure 2). chiens CXMD afficher la décomposition musculaire progressive, troubles de la marche, et les problèmes cardiaques et respiratoires semblables à ceux observés dans la DMD. Par rapport à un seul saut d&#39;exon, multi-saut d&#39;exon est applicable à une plus grande proportion de patients. Parmi les trois types de mutations les plus courantes (suppressions, non - sens, et duplications), 80-98% des patients pourraient être traités par le biais multi-saut d&#39; exon 14,32,33, alors que 45% de tous les patients atteints de DMD pourrait bénéficier d&#39;exons sauter spécifiquement 45 - 55 3,19,22,34. Avec le développement des morpholinos modifiés, l&#39;efficacité des cocktails AON à faciliter l&#39;exon skipping est améliorée. Riche en arginine peptide conjugué PMO de pénétration cellulaire (PPMOs) et in vivo-morpholinos (vPMOs) sont chimies AON qui ont considérablement amélioré la capacité et la stabilité 3,35-38 pénétrant dans les cellules. Des préoccupations demeurent quant à la toxicité à long terme AON; Cependant, des progrès significatifsa été fait. Les modifications chimiques apportées à morpholinos diminuent grandement les effets hors-cible et des études pré-cliniques ont rapporté aucun effet toxique significatif 3,22,39,40. Un autre défi pour le multi-saut d&#39; exon est l&#39;exigence actuelle pour chaque single AON à tester la toxicité seul, comme un seul médicament, au lieu d&#39;ensemble comme un cocktail 3,19,22,41,42. Dans les études DMD impliquant à la fois simple et multi-saut d&#39;exon ciblé sur le cœur, il y a eu peu d&#39;amélioration dans le tissu cardiaque dystrophique. L&#39;efficacité de morpholinos dans le cœur est considéré comme faible en raison de la capacité de pénétration cellulaire pauvres. PPMOs peptidiques conjugués ont permis d&#39; améliorer la capacité d&#39;AON de pénétrer les cellules cardiaques, augmentant ainsi la quantité de protéine de dystrophine fonctionnelle secourue au coeur 3,19,38. Ici, notre approche cocktail AON est longuement discuté, y compris la conception de séquences AON en utilisant le logiciel ESEfinder 43. Protocols pour des expériences de chien avec multi-saut d&#39;exon sont également décrits. CXMD J beagles ont été utilisés pour les exons 6 et 8 expériences à sauter. Multi-saut d&#39;exon dans le modèle de chien CXMD montre des résultats prometteurs, mais des défis demeurent qui doivent être surmontés avant qu&#39;ils ne soient cliniquement applicables.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une des maladies les plus courantes létaux génétiques dans le monde entier, causées par des mutations dans le dystrophine (DMD) gène. Le saut d&#39;exon emploie / molécules d&#39;ARN-like ADN court appelés oligonucléotides antisens (AON) qui restaurent le cadre de lecture et produisent des protéines plus courtes mais fonctionnelles. Cependant, la thérapie de sauter exon se heurte à deux obstacles majeurs: applicabilité limitée (jusqu&#39;à seulement 13% des patients peuvent être traités avec un seul médicament AON), et la fonction incertaine des protéines tronquées. Ces questions ont été abordées avec une approche cocktail AON. Alors qu&#39;environ 70% des patients atteints de DMD peut être traitée par un simple saut d&#39;exon (tous les exons combinés), on pourrait potentiellement traiter plus de 90% des patients atteints de DMD si exon multiples sauter à l&#39;aide cocktail médicaments antisens peut être réalisée. a été utilisé La canine liée à l&#39;X dystrophie musculaire (CXMD) modèle de chien, dont le phénotype est plus semblable aux patients DMD humains, pour tester l&#39;effic systémiquealpha- et de sécurité multi-saut d&#39; exon des exons 6 et 8. Le modèle de chien CXMD héberge une mutation du site d&#39;épissage dans l&#39; intron 6, conduisant à un manque de l&#39; exon 7 dans l&#39; ARNm de la dystrophine. Pour rétablir le cadre de lecture dans CXMD nécessite multi-exon skipping des exons 6 et 8; par conséquent, CXMD est un bon modèle animal de taille moyenne, pour tester l&#39;efficacité et la sécurité des multi-saut d&#39;exon. Dans l&#39;étude actuelle, un cocktail de morpholinos antisens ciblant l&#39;exon 6 et l&#39;exon 8 a été conçu et restauré l&#39;expression de la dystrophine dans les muscles squelettiques du corps entier. Méthodes de transfection / injection d&#39;oligos de cocktail et de l&#39;évaluation de l&#39;efficacité et la sécurité des multi-saut d&#39;exon dans le modèle de chien CXMD sont présentés.

Des expériences in vitro Les myoblastes ont été transfectées avec diverses conditions de traitement des 2&#39;OMePS afin de comparer l&#39;efficacité de chaque AON. traitements AON simples avec 600 nM chacune des Ex6A, Ex6B, Ex8A ou Ex8B ont été réalisées, ainsi qu&#39;un traitement de cocktail avec 600 nM chacune des 4 séquences AON. Des échantillons d&#39;ARN ont été prélevés quatre jours après la transfection. Après la RT-PCR, les échantillons pour chaque traitement ont été effectués sur un gel avec (NT) des échantillons non traités. Les bandes plus élevées sur le gel représentent out-of-frame produits DMD; ces bandes ont été observées chez NT, Ex8A et Ex8B myoblastes traités. Ex6A, Ex6B, Ex8A, et les myoblastes cocktail traités ont montré des produits en cadre. Le cocktail et Ex6A / B ont montré des produits 100% en cadre, tandis que Ex8A a montré que 30% des produits en cadre (figure 7). Pour confirmer le saut d&#39;exon et la restauration desle cadre de lecture, le séquençage d&#39;ADNc a été réalisée; les résultats indiquent que les exons 6-9 avaient en effet été ignorés (figure 7). L&#39; immunohistochimie a montré que les chiens traités par AON avaient augmenté de fibres dystrophine positives par rapport aux échantillons NT (figure 8). Des expériences in vivo Pour comparer l&#39;efficacité des différentes conditions de traitement AON, chiens CXMD (0,5 - 5 ans) ont été injectés une fois avec 1,2 mg Ex6A ou un cocktail de Ex6A, Ex6B et Ex8A à diverses doses. Deux semaines après l&#39;injection, des échantillons de muscles ont été prélevés et colorés avec DYS-1 à comparer le nombre de fibres dystrophine positives. Tous les échantillons de cocktail-traités ont montré une expression accrue de la dystrophine par rapport aux échantillons NT. Fibres dystrophine positives augmentent avec AON dosage (figure 9). système Suiteinjection ic, de type sauvage (WT), NT, et CXMD échantillons de muscle cocktail traités ont été colorés avec DYS-1 (figure 10). chiens CXMD Cocktail traités ont montré une augmentation expression de la dystrophine par rapport aux chiens NT CXMD, tant en CT et des échantillons du muscle cardiaque. Cependant, le muscle squelettique AON-traitée (CT) a montré une expression beaucoup plus élevé de dystrophine par rapport au muscle cardiaque traitée. Un immunoblot comparant WT, NT, et divers muscles cocktail traités morpholino a conduit à la même conclusion. Il y avait aussi une large gamme d&#39;expression de la dystrophine dans les échantillons de muscles squelettiques traités (figure 10). Hématoxyline et éosine (HE) ont révélé que la coloration traité CXMD les chiens ont montré une amélioration histopathologie, avec une diminution significative des fibres au centre nucléés (CNF) par rapport aux chiens NT CXMD (figure 11). Cela indique qu&#39;il ya plus de dégénérescence / régénération survenant chez le chien NT, un signe de pathologie dystrophique musculaire. En outre, les chiens traités ont rapidementles temps et les scores améliorés en cours d&#39;exécution sur l&#39;échelle de notation clinique. Chiens CXMD traités ont montré de meilleurs scores que les chiens NT CXMD dans toutes les catégories (figure 12). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figure 1. Mutation Motif du Chien CXMD et exons 6 -. 8 Stratégies Skipping Utilisation d&#39; un cocktail antisens chiens CXMD ont une mutation ponctuelle dans l&#39; exon 6 conduisant à une perte de l&#39; exon 7 dystrophique chien ARNm. Il en résulte l&#39;ARNm étant hors de trame et la production de protéine dystrophine est perdue. séquences AON courtes sont conçues pour se lier à l&#39;exon 6 et 8, qui se traduit par épissage de l&#39;ARNm sauter efficacement exons 6 - 8. La barre grise dans les chiens de cocktail traités AON représente de courtes séquences AON. Exon 9 code pour un domaine de charnière et est parfois spontanément épissé avec AONs contre exon 6 et 8. Les codes d&#39;ARNm résultant de la dystrophine protéines qui sont plus courtes, mais la fonctional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figure 2. Les symptômes cliniques majeures d&#39;un 1-year-old Canine X-linked Dystrophie musculaire (CXMD) des animaux. A 1-year-old beagle de type sauvage et un chien de CXMD sont présentés. L&#39;implication des proximal, des membres et des muscles temporaux sont généralement observés à partir de 2 mois d&#39;âge. Contracture commune et un déplacement du bassin sont manifestes à partir de 4 mois. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figure 3. anesthésie générale pour un chien. A) Intramusculinjections ar et biopsies musculaires sont réalisées sous anesthésie générale avec de l&#39;isoflurane. B) La tenue de l&#39;animal pour des injections systémiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figure 4. Imagerie par résonance magnétique (IRM) de type sauvage, non-traitée CXMD et traitée CXMD. IRM du membre postérieur à 3 mois et 5 mois dans WT et NT CXMD chiens. Deux exemples d&#39;images de traités de derrière CXMD Limb IRM (1 semaine avant la première injection) et post-injection de AON sont présentés. 2703MA a été traité par semaine 7x avec 200 mg / kg morpholinos cocktail. 2001MA a été traité avec 5 fois par semaine par injection intraveineuse de 120 mg / kg de cocktail morpholinos. Contrôle et chiens traités ont été appariés selon l&#39;âge. Les chiens traités montrent une diminution des signaux T2. Les images sont adap<html> ted avec la permission de Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figure 5. Muscle Biopsie pour un chien. A) Un membre inférieur est fixé pour la biopsie musculaire. B) Avec l&#39;aide de pinces, le membre inférieur est maintenu. C) Le muscle CT est exposé. technique de biopsie ouverte est utilisée pour obtenir des échantillons de muscle de sites injectés. Les fils sont utilisés pour contenir des échantillons de biopsie. Échantillons D) Muscle sur la gomme adragante après dissection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figure 6. Méthode de transfert semi-sec. Une représentation de la méthode semi-sèche transfert pour Western blot est présentée. Trois papiers imbibés dans un tampon d&#39;anode concentré sont fixées à la borne négative; 3 papiers imprégnés dans le tampon d&#39;anode sont empilées au-dessus de ce produit. Le papier Mb PVDF est trempée dans un tampon d&#39;anode méthanol, puis avant d&#39;être mis au-dessus des 6 papiers. Le gel, qui a été trempée dans du tampon de cathode, est posé doucement sur le papier de PVDF. Enfin, 3 papiers imprégnés dans le tampon de cathode sont disposées au-dessus du gel. La borne positive est fixée sur le dessus. Pour 1 heure, 400 mA est géré par le système. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figure 7. Exon Skipping dans CXMD myoblastes. </strong&gt; myoblastes CXMD ont été transfectées avec Ex6A, Ex6B, Ex8A ou Ex8B seul, ou un cocktail de quatre. Un total de 600 nm a été utilisée pour les séquences individuelles et pour le cocktail 600 nM de chaque séquence a été utilisée. A) 2&#39;OMePS traitement dans CXMD myoblastes de chien. Ex6A, Ex6B, et les échantillons de cocktail traités montrent des bandes fortes à la position attendue de transcrits en cadre exon-sautée. Ex8A montre une bande intermédiaire, Ex8B montre une bande faible, et NT ne montre pas une bande à la position dans le cadre. B) le séquençage de l&#39;ADNc à partir Ex6A seul 4 jours après la transfection. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Dystrop figure 8. Augmentationhin Expression dans 2&#39;O-méthylés phosphorothioate (2&#39;OMePS) transfectées CXMD myoblastes. myoblastes CXMD ont été transfectées avec Ex6A seul ou avec 2&#39;OMePS cocktails. DYS-2 (rouge) et DAPI (bleu) coloration sont présentés. Les myoblastes traités sont comparés au type sauvage (WT) et (NT) myoblastes non traités. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figure 9. Expression de sauvetage de la dystrophine avec des injections intramusculaires Morpholinos dans CXMD chiens. Soit Ex6A seul ou un cocktail de Ex6A, Ex6B et Ex8A ont été injectés dans les muscles des chiens CT CXMD. Dystrophine (DSY-1) coloration de type sauvage(WT), non-traités (NT), et les chiens CXMD traités sont présentés. Les chiens ont été soit traités avec 1,2 mg Ex6A seul ou 1,2 mg cocktail. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figure 10. Augmentation de la dystrophine Expression Après Cocktail systémique Traitement morpholino dans CXMD Chiens. Dystrophine (DYS-1) coloration a été utilisé pour comparer l&#39; expression de la dystrophine dans le type sauvage (WT) (contrôle positif), non traité (NT) (contrôle négatif), et les chiens CXMD traités avec 120 mg / kg de cocktail morpholino (40 mg / kg de chaque AON). Le cocktail morpholino contenait Ex6A, Ex6B et Ex8A. Les chiens ont été injectés par voie intraveineuse 5 fois nousekly avec ce cocktail. A) Une comparaison de l&#39;expression de la dystrophine dans tibial cranial (CT) muscles du WT, NT, et les chiens traités. B) Une comparaison de l&#39;expression de la dystrophine dans le tissu cardiaque entre NT et morpholino chiens cocktail traité. C) Immunoblot pour dystrophine avec desmine comme un contrôle de chargement est indiqué pour WT, NT, et morpholino chiens cocktail traité. Les muscles suivants sont présentés pour les chiens traités: triceps brachial (TB), biceps brachial (BB), le diaphragme (DIA), de l&#39;œsophage (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), masséter (MAS), et le cœur. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figure11. Amélioration de l&#39; histopathologie en CXMD chiens traités pendant 7 semaines avec 240 mg / kg morpholino Cocktail. Chiens CXMD allant d&#39;une demi - année à l&#39; âge de cinq ans ont été injectés par voie intraveineuse avec 240 mg / kg morpholino cocktail (Ex6A, Ex6B et Ex8A) une fois semaine pendant 7 semaines. Quatorze jours après la dernière injection, les muscles de l&#39;œsophage ont été prises et hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration a été fait. HE coloration des muscles de l&#39; œsophage de non-traités (NT) et morpholino cocktail traité (traité) chiens CXMD (40X objectif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figure 12. Scores amélioré classement clinique et 15 m Temps de marche Après les chiens Traitement morpholino. Morpholino-traités ont été comparés aux non-traités (NT) littermates. Les barres d&#39;erreur dans le graphique indiquent SEM. A) Le score total sur l&#39;examen de classement clinique a été calculé avant et après le traitement et les animaux traités ont été comparés avec les congénères NT. B) Une comparaison de 15 m temps de course de chiens traités et NT. C) similaires à B; Cependant, les jeunes chiens ont été utilisés. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligonucléotide antisens </td><td> Nucleotide Sequence </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Conception Oligonucléotide anti - sens.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-exon Sauter Utilisation Oligonucleotides Cocktail antisens dans la dystrophie musculaire Canine liée à l&#39;X

Le saut d&#39;exon est actuellement une option thérapeutique la plus prometteuse pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Pour étendre l&#39;applicabilité des patients atteints de DMD et d&#39;optimiser la stabilité / fonction des protéines de la dystrophine tronquée résultant, un multi-saut d&#39;exon approche utilisant des oligonucléotides antisens cocktail a été développé et nous avons démontré systémique sauvetage de la dystrophine dans un modèle de chien.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Assay Muscle Fonction Canine

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Recherche

Médecine

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Protocole de dosage à base de cellules pour la prédiction du pronostic de la scoliose idiopathique de l&#39;aide Cellular Spectroscopie Diélectrique

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l&#39;urine cellules dérivées

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolement et culture de cellules endothéliales primaires de Artères Canine et Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Évaluation de l’Inclusion d’Exon induite par Splice commutation oligonucléotides antisens de fibroblastes de patients de SMA

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Thrombose de l’artère carotide Canine induite par le chlorure ferrique : Un grand modèle Animal de lésion vasculaire

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Mesures de la fonction motrice et d’autres paramètres de résultats cliniques chez les enfants Ambulant avec dystrophie musculaire de Duchenne

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Caractérisation de l’efficacité de saut d’Exon dans les échantillons de patients de DMD dans les essais cliniques d’oligonucléotides d’Antisense

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Utilisation d’une biopsie chimique pour l’évaluation de la qualité de la greffe

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...