Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

דילוג על אקסונים הוא טכניקה טיפולית מבטיחה לטיפול DMD. הן במבחנה בניסויים vivo הראו כי דילוג רב אקסון אינו ריאלי. כאן, השימוש במודל כלב CXMD נדון. ראשית, AONs תוכננו באמצעות התוכנית Rescue-ESE ותוכניות ESEfinder למקד אקסונים בדיסטרופין 6 - 8. כימיה 2&#39;OMePS AON שימש transfection myoblast CXMD והכימיה עמוד השדרה AON morpholino נבחר לניסויים in vivo. vPMOs הם יעיל יותר מאשר PMOS ללא שינוי אך בשל הרעילות הגבוהה שלהם הוא אינם מתאימים זריקות מערכתיות. מיצוי RNA, RT-PCR, וסדר cDNA בוצעו על myoblasts CXMD. הכלבים מוזרקים עם קוקטייל PMO דורגו קליני להעריך כל שיפור בתסמינים קליניים. לאחר שהכלבים היו מורדמים אנושיים, דגימות שריר נלקחו והוכנו-חתך cryo. זמן מחצית החיים של חלבון הדיסטרופין המושרה על ידיONS הוא האמין להיות כ 1 - 2 חודשים. כלבים בוגרים צעירים שימשו במחקר זה, אם כי ניסויים אלה ניתן לעשות עם כלבים ילודים כלבים מבוגרים (&gt; בן 5 שנים). סעיפי שריר מוכנים שמשו להעריך histopathology ולהעריך חלבון הצלה בדיסטרופין באמצעות מערבי סופג אימונוהיסטוכימיה 48. חשוב להבטיח כי היקף פתרון PMO נכון לפני זריקות; אי לעשות זאת תהיה השפעה משמעותית על תוצאות. במהלך זריקה תוך שרירית, לחץ מספיק נדרש להזין סיבי השריר. ניטור של כלב בריאות ובדיקה של אתר הניתוח חשוב לפתרון בעיות. כדי לפקח על בריאות בעלי חיים, בדיקות דם שבועיות ומשקל צריכות להתבצע. לאחר euthanization של החיה והכנה דגימות שריר, צעד חיוני להבטחת רגישות באיתור חלבון בדיסטרופין הוא להשתמש בשני הג&#39;ל טריס-יצטט ושיטה סופג חצי יבשהבמהלך ההליך המערבי סופג. כפי שניתן לראות בתוצאות הנציג, myoblasts שטופל Ex6A, Ex6B, Ex8A, ואת הקוקטייל (המכיל Ex6A, Ex6B, Ex8A, ו Ex8B) מיוצר מסגרת מוצרי DMD. מאז Ex8B הניבה שום מוצרים אקסון-דלג, זה לא היה בשימוש לאחר בניסויי vivo. רצף cDNA הראה כי אקסונים 6 - דילוג 9 התרחשה immunocytochemistry עם מכתים פרע-2 הראה משוחזר ביטוי בדיסטרופין בדגימות מטופל. AON שטופלו כלבים הראו עלייה משמעותית בסיבים בדיסטרופין חיובי. זה מצביע על כך אקסונים 6 - 8 היו מדלגים עליו לבין חלבון מקוצר הופק. כמות הסיבים בדיסטרופין החיובי מוגברת כאשר קוקטייל של AONs שמש והייתה פרופורציונאלי מינון AON. Immunoblots והראה גדילת ביטוי בדיסטרופין בכלבים מערכתיים שטופל morpholino. שרירי שלד היו רמות משתנות של סיבים בדיסטרופין; עם זאת, רקמת לב שטופלו morpholino הראה מעטשיפור הביטוי בדיסטרופין. מאז בדיסטרופין יש משקל מולקולרי גבוה (427 KDA), זיהוי של כמויות נמוכות בדיסטרופין יכול להיות קשה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ג&#39;ל טריס-יצטט ואת שיטת ההעברה-יבש למחצה היו בשימוש. HE מכתים הראה histopathology השתפר כלבים שטופלו morpholino. מרכזי-גרעיני סיבים (CNFs) הם סימן של שריר בריא ולייצג מחזורים של ניוון שרירים והתחדשות. Morpholino שטופלו כלבים CXMD נרשמה ירידה באחוז CNFs בהשוואה לכלבים CXMD שאינם מטופלים. לדירוג קליני גילה שיפור בתסמינים, כגון הליכה מוגברת ויכולת לרוץ, בחיות שטופלו morpholino. הקשיות של השרירים הוא האמין כדי לשקף ניוון שרירים, ובכך, הוא נכלל בתכנית לדירוג 59. הקשיות של ירך (אחורי-איבר) שרירים הוערכה; עם זאת, לא כללנו שרירים גולגולתי סארטוריוס כי הן נוטות להציג היפרטרופיה ולא ניוון ב CXMD. המטופלים כלבים להראותאד ציונים לדירוג נמוכים והיו פעמים מהר על מבחן הריצה 15 מ &#39;. פעמים משופרות במבחן 15 מ &#39;מעידות על תפקוד שרירים משופר 40. עשרות לדירוג כוללים גבוהים מצביעים בריאות לקויה וניוון שרירים מוגבר. למרות שתוצאות אלה אינן מבטיחות, מדלגים-אקסון רב עדיין מציבה בפנינו אתגרים רבים כי יהיה צורך להתגבר לפני יש את הטכניקה ישימות קלינית. ברקמת לב עדיין מציגה ספיגה מופחתת של AONs, ככל הנראה בשל ההבדל בסחר הסלולר בין רקמת לב שלד. אין השפעות רעילות נצפו בבעלי חיים תחת משטרי מינון נוכחיים; עם זאת, יותר עבודה שצריך לעשות על מנת להעריך רעילות ארוכי טווח לפני והשלכת בקבוקי AON יכול לעבור ניסויים קליניים. קשה לקבל אישור לתרופות קוקטייל AON כי רשויות רגולטוריות להגדיר כל רצף AON כתרופה ייחודית. משמעות הדבר היא כי כל רצף קוקטייל היה צריך להיבדק בנפרד עבור Safety, הדורשים יותר זמן ויותר כסף. מחסום נוסף על שימוש דילוג רב אקסון בסביבה קלינית הוא כמות גדולה של מוצרי חלבון הביניים מיוצרים עם פונקציות ידועות. חלבונים אלה עלולים לגרור פעולות תופעות לוואי בלתי צפוי, תלוי מוטצית פרט 22. בנוסף, דפוסי המוטציה הזמינים בתוך מודלי כלב דיסטרופי הנוכחיים מוגבלים. ישנם כמה מוטציות טבעיות המתחוללות, ולא כל המוטציות הן שימושיות לחקר דילוג אקסון-רב. מודל חזיר דיסטרופי מבטיח להיות אלטרנטיבה טובה עבור אקסון בעתיד DMD דילוג מחקרים 33, 34. המודלים כלב DMD יש כמה יתרונות על פני מודלים DMD אחרים. להיות לדירוג קליני, במודל חיה גדול ו- MRI אפשרי, המאפשר ניתוח מפורט יותר. מאז כלבים הם בעלי חיים גדולים הם גם יותר מתאימים מחקרי רעלים ועוד מקרוב מייצגי המחלה האנושית בהשוואה למודל העכבר. כלב מodels גם יש רצפי גנים DMD, כי הם יותר דומים לבני אדם 23, 34, 45. למרות שטכנית מאתגר, גישת הדילוג הרב אקסון יכולה בסופו של דבר ליהנות&gt; 90% מחולי DMD 24. זה עושה את זה אלטרנטיבה הרבה יותר טובה כדי דילוג חד אקסון, כמו דילוג חד אקסון הוא חל רק על קבוצה קטנה של חולים. בנוסף, דילוג רב אקסון יאפשר לנו לבחור את דפוסי המחיקה המביאות למרב את הפונקציונליות של חלבונים בדיסטרופין מקוצר. לדוגמא, מחיקת DMD אקסונים 45 - 55 קשורים לסימפטומים קלים במיוחד או אנשים ללא תסמינים 14,19,60-63. את מדלגת רב אקסון של אקסונים 45 - 55 כבר הודגמה במודל של עכברים של DMD עם המחיקה 52 אקסון (mdx52) באמצעות זריקות מערכתית של 22,26 vPMOs. שימוש קוקטייל vPMOs גם הודגם צורות אחרות של ניוון שרירים, כגוןניוון שרירים מולד פוקויאמה (FCMD). FCMD נגרמת על ידי לכידת אקסון, שבו שחבור mRNA סוטה נגרם על ידי החדרת retrotransposon. vPMOs הוכח להציל את דפוס השחבור בשני מודל עכבר FCMD וב שורות תאים אנושיים 64. כימיות AON הדור הבא מציגות יעילות גבוהה רעילות נמוכה תקלנה על התרגום היעיל של גישת דילוג הרב אקסון לתוך יישום קליני. בנוסף, דילוג רב אקסון שעלול להיות מיושם על הפרעות גנטיות אחרות, כגון dysferlinopathies 24, 65.

ניוון שרירים דושן (DMD) היא מחלה שרירים רצסיבי צמודי X שמתאפיין בחולשת שרירים מתקדמת, תוארה לראשונה על ידי ד&quot;ר גיום-בנימין-אמאנד דושן (בולון) 1. DMD היא מחלה גנטית נפוצה המשפיעה על 1 ב -3,500 נערים ברחבי העולם, עם כ -20,000 ילדים מושפעים הנולדים בכל שנה 2,3. התפתחות מוטורית מתעכבת והפרעות בהליכה נראות בתחילת ילדות 4, ואחריו תלות גלגלים בערך העשרה המוקדמים. המוות מתרחש בדרך כלל בין הגילאים 20 ו -30 בשל כשל נשימתי או לבבי 5-8. אין כרגע תרופה DMD. טיפול עם גלוקוקורטיקואידים יכול להאט את התקדמות ניוון שרירים מסוים אך קשור לתופעות לוואי משמעותיות, כגון: השמנת יתר וסוכרת 2,7,8. DMD הנובעת מוטציות בגן בדיסטרופין (DMD), שמוביל לאובדן של protei בדיסטרופין פונקציונליn. DMD הוא גן גדול מאוד עם יותר מ -2 מיליון זוגות בסיסים ו -79 אקסונים 9,10. מחיקה, שטויות, ומוטציות שכפולות המוביל מוטציות מחוץ למסגרת הן הסיבה השכיחה ביותר של פנוטיפ DMD. האזורים של אקסונים 3 - 9 וגם אקסונים 45 - 55 מכונים &quot;נקודות חמות מוטציה&quot; כמו שיש רוב החולים מוטציות מחיקות בתוך חלקים אלה של הגן, מה שמוביל בדיסטרופין שאינו פונקציונלי בחולי DMD 3,9,11-16. בדיסטרופין פונקציות במתחם גליקופרוטאין-בדיסטרופין (DGC), אשר יש תפקיד מרכזי בייצוב קרום השריר. N- ו- C-Termini הם התחומים החשובים ביותר לתפקוד, בעוד תחום המוט המרכזי ממלא 3,9,17 תפקיד חשוב פחות. השמירה על פנוטיפ קל הקשורים בניוון שרירי בקר (BMD), שתוצאתה בעיקר מוטציות בתוך המסגרת בתוך גן DMD, בהשראת היישום של אקסון דילוג לטיפול DMD. חולי BMD שיהיו לך מקוצר, אבל functional, חלבון בדיסטרופין מקיים הוא טרמיני 3,6,18. אקסון מדלג, בתאוריה, ניתן לשחזר את מסגרת הקריאה, וכתוצאה מכך חלבונים בדיסטרופין מקוצרים-אבל-תפקודיים דומים לזו של BMD 3,19. סוגים שונים של מולקולות אנטיסנס (AONs) נבדקו במחקרים קליניים, כולל phosphorothioates-מפוגל 2&#39;O (2&#39;OMePS) ו oligomers morpholino phosphorodiamidate (PMOS). אקסונים דילוג 51 ו -53 באמצעות AONs אלה נבדקים תוך ותוצאות מבטיחות, דילוג חד אקסון יש תחולה מוגבלת, כפי שהוא מוטציה ספציפית 3, 19, 20,21, 22-26. שאלות גם להישאר על היציבות של חלבונים בדיסטרופין מקוצר וכתוצאה המופק-אקסון בודד דילוג 22,23. בנוסף, חולים מסוימים דורשים יותר מאשר אקסון בודד שברצונכם לדלג עליו כדי להחזיר את מסגרת הקריאה 3. למרות שמבחינה טכנית קשה יותר, מדלגים-אקסון רב היא אחת השיטות כייכול לטפל בבעיות אלה 3,19. דילוג רב-אקסון הודגם בעבר כלב דיסטרופי ואת שורות תאים אנושיות במבחנה. בנוסף, ניוון שרירים צמוד X העכבר כלבי mdx52 (CXMD) מודלי כלב שמשו במשך במחקרים vivo 22, 24-27. X-linked כלבים ניוון שרירים יפן (CXMD J) כלבי ציד שימשו כאן, כמו את מסגרת הקריאה של CXMD J ניתן לשחזר על ידי דילוג רב אקסון של אקסונים 6 ו -8, או אקסונים נוספים (למשל, אקסונים 3 - 9) (איור 1). ביגל המבוסס CXMD חולקת אותו דפוס המוטציה כמו ניוון שרירי גולדן רטריבר (GRMD) המודל, אבל כלבי ציד קטנים וזולים יותר כדי לשמור על עקב גודל גופם, ובכך לספק מודל שימושי DMD 28,29. כלבי CXMD לחקות באופן הדוק יותר את הפנוטיפ DMD האנושי מאשר במודלים של בעלי חיים קטנים, כמו מכרסמים, והם אמינים יותר להערכות טוקסיקולוגית 3,22,30,31 </sעד&gt; (איור 2). כלבי CXMD להציג ריקבון שרירים מתקדם, הפרעות בהליכה, ובעיות לב ונשימה דומה לאלה שראו DMD. לעומת דילוג חד אקסון, מדלגים-אקסון רב ישימים חלק הרבה יותר גדולה של חולים. בין שלושת סוגי המוטציה הנפוצה ביותר (מחיקות, שטויות, כפילויות), 80 - 98% מהחולים יכולים להיות מטופלים באמצעות רב אקסון דילוג 14,32,33, בעוד 45% מכלל חולי DMD יכול להפיק תועלת אקסונים דילוג במיוחד 45 - 55 3,19,22,34. עם התפתחותה של morpholinos השונה, את היעילות של קוקטיילי AON להקל דילוג אקסון השתפרה. ארגינין עשיר PMOS פפטיד מצומדות חודר תאים (PPMOs), ו vivo-morpholinos (vPMOs) הם כימיות AON ששיפרו משמעותית חודר תאים היכולת ויציבות 3,35-38. חששות להישאר על רעילות ארוכי טווח AON; עם זאת, התקדמות משמעותיתנעשה. שינויים כימיים שבוצעו morpholinos להקטין באופן משמעותי השפעות חוץ-היעד של סקרי טרום קליניים דיווחו ללא תופעות רעילות משמעותית 3,22,39,40. אתגר הנותרים עבור דילוג רב אקסון היא הדרישה הנוכחית עבור כל אחת AON להיבדק לרעילות לבד, כתרופה יחידה, במקום יחד כמו קוקטייל 3,19,22,41,42. במחקרי DMD המעורבים הוא-אקסון רב יחיד מדלגים ממוקדת בלב, חל שיפור קטן ברקמת לב דיסטרופי. יעילותה של morpholinos בלב הוא חשב להיות נמוך בגלל היכולת החודרת-תא עני. פפטיד מצומדות PPMOs שיפרו את היכולת של AONs לחדור תאי לב, הגדלת כמות החלבון בדיסטרופין פונקציונלי הצילה בלב 3,19,38. הנה, גישת קוקטייל AON שלנו נדונה בהרחבה, לרבות עיצוב רצפי AON באמצעות ESEfinder תוכנה 43. ProtocOLS עבור ניסויים בכלבים עם דילוג רב אקסון מתואר גם. CXMD J כלבי ציד שימשו אקסונים 6 ו -8 ניסויים מדלגים. Multi-אקסון דילוג במודל כלב CXMD מראה תוצאות מבטיחות, אך אתגרים להישאר להיות להתגבר שהצורך לפני שהם קליניים ישימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

ניוון שרירים דושנו (DMD) הוא אחת המחלות הגנטיות הקטלנות הנפוצות ביותר בעולם, נגרמים על ידי מוטציות בגן בדיסטרופין (DMD). דילוג על אקסונים מעסיק דנ&quot;א קצר / מולקולות דמויות RNA שנקראים מולקולות אנטיסנס (AONs) כי לשחזר את מסגרת הקריאה ולייצר חלבונים קצרים אך פונקציונליים. עם זאת, טיפול דילוג אקסון ניצבת בפני שני מכשולים עיקריים: תחולה מוגבלת (עד רק 13% מהחולים יכול להיות מטופלים עם תרופה אחת AON), ותפקוד ודאית של חלבונים קטועים. טופלו נושאים אלו עם גישה AON קוקטייל. בעוד כ 70% מחולי DMD יכולים להיות מטופלים על ידי דילוג אקסון בודד (כל אקסונים המשולבים), אפשר לטפל פוטנציאל ליותר מ -90% מחולי DMD אם אקסון המרובה דילוג באמצעות תרופות antisense קוקטייל יכול להתממש. הכלב X-linked ניוון שרירים מודל כלב (CXMD), פנוטיפ אשר דומה יותר בחולים אנושיים DMD, שימש כדי לבדוק את effic מערכתיתחרדה ובטיחות של דילוג רב אקסון של אקסונים 6 ו -8 מודל הכלב CXMD נמלי מוטצית אתר שחבור ב אינטרון 6, מוביל חוסר אקסון 7 ב mRNA בדיסטרופין. כדי לשחזר את מסגרת הקריאה CXMD דורש דילוג אקסון-רב של אקסונים 6 ו -8; ולכן, CXMD הוא מודל חיה בגודל בינוני טוב לבדיקת היעילות והבטיחות של דילוג רב אקסון. במחקר הנוכחי, קוקטייל של morpholinos antisense מיקוד אקסון 6 ו אקסון 8 תוכנן וזה החזיר ביטוי בדיסטרופין בשרירי שלד-רחב גוף. שיטות transfection / הזרקה של oligos קוקטייל והערכה של היעילות והבטיחות של דילוג רב אקסון במודל כלב CXMD מוצגים.

בניסויים במבחנה Myoblasts היה transfected עם תנאי טיפול שונים 2&#39;OMePS כדי להשוות את היעילות של כל AON. טיפולים AON יחיד עם 600 ננומטר אחד Ex6A, Ex6B, Ex8A, או Ex8B נעשו, כמו גם טיפול קוקטייל עם 600 ננומטר כל אחד 4 כל רצפי AON. דגימות רנ&quot;א נאספו ארבעה ימים לאחר transfection. לאחר RT-PCR, דגימות עבור כל טיפול נוהלו על ג&#39;ל יחד עם דגימות שאינם מטופלים (NT). להקות גבוהות על הג&#39;ל מייצג מחוץ למסגרת מוצרי DMD; להקות אלה נראו NT, Ex8A, ו Ex8B מטופלים myoblasts. Ex6A, Ex6B, Ex8A, ואת myoblasts שטופל הקוקטייל הראו מוצרים בתוך המסגרת. קוקטייל ו Ex6A / B הראה 100% ב-מסגרת מוצרים, תוך Ex8A הראה ל 30% ב-מסגרת מוצרים (איור 7). כדי לאשר אקסון מדלגים ושיקוםאת מסגרת הקריאה, רצף cDNA בוצע; הממצאים הצביעו על כך אקסונים 6 - 9 כבר דילג אכן (איור 7). אימונוהיסטוכימיה הראה כי כלבים שטופלו AON עלו סיבים חיוביים בדיסטרופין לעומת דגימות NT (איור 8). בניסויים Vivo כדי להשוות את היעילות של תנאי טיפול שונים AON, כלבי CXMD (0.5 - 5 שנים) הוזרקו פעם עם 1.2 מ&quot;ג Ex6A או קוקטייל של Ex6A, Ex6B, ו Ex8A במינונים שונים. שבועיים לאחר ההזרקה, דגימות שריר נאספו מוכתם פרע-1 כדי להשוות את מספר סיבי חיובי בדיסטרופין. כל הדגימות שטופלו הקוקטייל הראו ביטוי בדיסטרופין מוגבר לעומת דגימות NT. בדיסטרופין חיוב סיבים מוגברים עם AON מינון (איור 9). המערכת הבאההזרקת ic, wild-type (WT), NT, דגימות שריר CXMD שטופלו קוקטייל הוכתמו פרע-1 (איור 10). קוקטייל שטופל כלבי CXMD והראו גדילת ביטוי בדיסטרופין לעומת כלבי NT CXMD, הן CT דגימות שריר לב. עם זאת, שרירי השלד שטופלו AON (CT) הראה הרבה ביטוי גבוה בדיסטרופין לעומת שריר הלב ומטופל. Immunoblot השוואת WT, NT, ו שוני שרירי morpholino שטופל קוקטייל הוביל לאותה המסקנה. היה שם גם מגוון גדול של ביטוי בדיסטרופין בדגימות שרירי השלד שטופלו (איור 10). Hematoxylin ו eosin (HE) מכתים גילה כי מטופלים CXMD כלבים הראה histopathology משופרת, עם ירידה משמעותית סיבי-גרעיני מרכזי (CNF) בהשוואה לכלבים NT CXMD (איור 11). זה מצביע שיש ניוון יותר / התחדשות המתרחשים כלב NT, סימן פתולוגיה שריר dystrophic. בנוסף, כלבים שטופלו היו מהרפועל פעמים ועשרות משופרת על סולם לדירוג קליני. כלבי מטופלי CXMD הראו ציונים טובים יותר מאשר כלבי NT CXMD בכל הקטגוריות (איור 12). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> תבנית מוטציה באיור 1. של CXMD כלב וגם אקסונים 6 -. 8 אסטרטגיות דילוג שימוש קוקטייל אנטיסנס כלבים CXMD יש מוטציה טעם אקסון 6 שמוביל לאובדן של אקסון 7 ב mRNA כלב דיסטרופי. זו התוצאה של mRNA להיות מחוץ למסגרת וייצור חלבון בדיסטרופין הולך לאיבוד. רצפי AON קצרים נועדו להיקשר אקסון 6 ו -8, שתוצאתה שחבור mRNA דילוג ביעילות אקסונים 6 - 8. הסרגל האפור כלבי הקוקטייל שטופל AON מייצג רצפי AON קצרים. אקסון 9 מקודד תחום ציר ולפעמים עובר שחבור החוצה באופן ספונטני עם AONs נגד אקסון 6 ו -8 הקודים mRNA שנוצר עבור בדיסטרופין חלבונים כי הם קצרים אך פונקציהal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> איור 2. תסמינים קליניים רחבי היקף של בעלי חיים 1 בן ניוון שרירים כלב X-צמודות (CXMD). ביגל wild-type 1 בן וכלב CXMD מוצגים. המעורבות הפרוקסימלי, איבר, ושרירים זמניים בדרך כלל הם נצפו מ 2 חודשים של גיל. התכווצות משותפת הסטה של האגן גלוי מגיל 4 חודשים של גיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> איור 3. הרדמה כללית על כלב. א) Intramusculזריקות ar וביופסיות שריר מתבצעים תחת הרדמה כללית עם isoflurane. B) קיום חית זריקות מערכתיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> איור 4. דימות תהודה מגנטית (MRI) של wild-type, שאינם מטופלים CXMD, והתייחסו CXMD. סריקות MRI של הגפיים האחוריות לאחר 3 חודשים ו -5 חודשים ב WT וכלבים NT CXMD. שתי תמונות מדגם של טרום בבדיקות MRI הגפיים האחוריות CXMD מטופלים (1 שבוע לפני הזריקה הראשונה) ו לאחר ההזרקה של AON מוצגים. 2703MA טופל שבועי 7x עם 200 מ&quot;ג / morpholinos קוקטייל הק&quot;ג. 2001MA טופל הזרקת IV שבועית 5x של 120 מ&quot;ג / morpholinos קוקטייל קילו. שליטה והכלבים מטופלים היו שוות גיל. כלבי מטופלים מראים ירידת אותות T2. תמונות ADAP<html> טד באישור ואח יוקוטה. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> שרירי איור 5. נוהל ביופסיה עבור כלב. א) גפיים תחתונים הוא קבוע עבור ביופסיה של שריר. B) בעזרת מלקחיים, הגפה התחתונה מתקיימת. ג) שריר CT חשוף. טכניקת ביופסיה להרחיב משמשת להשיג דגימות שריר אתרים מוזרקים. אשכולות משמשים כדי להחזיק דגימות ביופסיה. D) דגימות שריר על מסטיק tragacanth לאחר דיסקציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6. שיטת העברה חצי יבשים. ייצוג של שיטת ההעברה-יבש למחצה עבור מערבי סופג מוצג. שלושה עיתונים ספוגים חיץ האנודה מרוכז מוטלים למטה במסוף השלילי; 3 ניירות טבולים חיץ האנודה נערמים על גבי זו. העיתון PVDF Mb הוא שרוי בתוך חיץ האנודה מתנול ולאחר מכן בטרם הניח על גבי 6 בעיתונים. הג&#39;ל, אשר כבר ספוג חיץ קתודה, הוא הניח בעדינות על נייר PVDF. לבסוף, 3 ניירות טבולים חיץ קטודה מוטלים על גבי הג&#39;ל. המסוף החיובי מוגדר על גבי. במשך שעה 1, 400 mA מנוהלת באמצעות המערכת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> איור 7. אקסון דילוג ב CXMD myoblasts. </stרונג&gt; myoblasts CXMD היה transfected עם Ex6A, Ex6B, Ex8A, או Ex8B לבד, או קוקטייל של כל הארבעה. סך של 600 ננומטר שמש רצפי הפרט לקוקטייל 600 ננומטר של כל רצף היה בשימוש. א) 2&#39;OMePS טיפול ב myoblasts כלב CXMD. Ex6A, Ex6B, ואת הדגימות שטופלו הקוקטייל להראות להקות חזקות במיקום של בתוך המסגרת הצפויה תמלילי אקסון-דלג. Ex8A מציג להקת ביניים, Ex8B מציגה להקה חלשה, NT אינו מציג להקה במיקום בתוך המסגרת. B) רצף cDNA מ Ex6A לבד, 4 ימים לאחר transfection. תמונות מותאמות באישור יוקוטה et al. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> איור 8. מוגברת Dystropהביטוי הין ב 2&#39;O-מפוגל Phosphorothioate (2&#39;OMePS) transfected CXMD myoblasts. myoblasts CXMD היו transfected עם Ex6A לבד או עם 2&#39;OMePS קוקטייל. פרע-2 (אדום) ו DAPI (כחול) מכתים מוצגים. Myoblasts מטופלים מושווים wild-type (WT) ואת שאינם מטופלים myoblasts (NT). תמונות מותאמות באישור יוקוטה et al. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. בר = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> הצלת איור 9. ביטוי בדיסטרופין עם תוך שרירית זריקות של Morpholinos ב CXMD כלבים. כך או Ex6A לבד או קוקטייל של Ex6A, Ex6B, ו Ex8A הוזרקה שרירי CT של כלבי CXMD. בדיסטרופין (DSY-1) מכתים של wild-type(WT), שאינם מטופלים (NT), והתייחסו כלבים CXMD מוצגים. כלבים טופלו או עם 1.2 מ&quot;ג Ex6A לבד או 1.2 קוקטייל מ&quot;ג. תמונות מותאמות באישור יוקוטה et al. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> איור 10. גברת ביטוי בדיסטרופין לאחר קוקטייל מערכתי טיפול Morpholino ב CXMD כלבים. בדיסטרופין (פרע-1) מכתים שמש להשוות ביטוי בדיסטרופין ב סוג בר (WT) (בקרה חיובית), שאינו מטופלים (NT) (שליטה שלילית), כלבים CXMD שטופלו 120 מ&quot;ג / ק&quot;ג morpholino קוקטייל (40 מ&quot;ג / ק&quot;ג של כל AON). קוקטייל morpholino הכלול Ex6A, Ex6B, ו Ex8A. כלבים היו מוזרק לווריד 5 פעמים אנוekly עם הקוקטייל הזה. א) השוואת ביטוי בדיסטרופין ב שוקה גולגולתי (CT) שרירי WT, NT, וכלבי מטופלים. ב) השוואת ביטוי בדיסטרופין ברקמת לב בין NT ו morpholino כלבים שטופל קוקטייל. C) immunoblot עבור בדיסטרופין עם desmin כביקורת הטעינה יוצג למשך WT, NT, ו morpholino כלבים שטופלו קוקטייל. השרירים הבאים מוצגים לכלבים מטופלים: triceps brachii (TB), שרירי brachii (BB), הסרעפת (DIA), הוושט (ESO), CT, adductor (ADD), longus digitorum פושטי (EDL), masseter (MAS), ולב. תמונות מותאמות באישור יוקוטה et al. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. בר = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> דמות11. שיפור Histopathology ב CXMD כלבים שטופלו 7 שבועות עם 240 מ&quot;ג / ק&quot;ג Morpholino קוקטייל. כלבים CXMD החל חצי שנה עד חמש שנים היו מוזרק לווריד עם 240 מ&quot;ג / ק&quot;ג קוקטייל morpholino (Ex6A, Ex6B, ו Ex8A) פעם בשבוע במשך 7 שבועות. ארבעה עשר יום לאחר הזריקה האחרונה, שרירי הוושט נלקחו hematoxylin ו eosin (HE) מכתים נעשה. HE מכתים של שרירי הוושט מן שטופלו הלא (NT) ואת morpholino קוקטייל שטופלו (צבוע) כלבים CXMD (40X עדשה אובייקטיבי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> איור 12. ציונים משופרים על דירוג קליני 15 מ &#39;ריצת זמן לאחר Morpholino הטיפול. כלבים שטופלו Morpholino הושוו שאינם מטופלים (NT) להמלטהים. ברי שגיאה בגרף עולים SEM. א) ניקוד כולל בבחינה לדירוג הקלינית חושב לפני ואחרי טיפול חיות שטופלו הושוו עם להמלטת NT. ב) השוואה של 15 מ &#39;פעמים ריצה של כלבים מטופלים NT. C) דומה ל- B; עם זאת, כלבים צעירים שימשו. תמונות מותאמות באישור יוקוטה et al. (זכויות יוצרים 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אנטיסנס oligonucleotide </td><td> רצף נוקליאוטידים </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> טבלת 1. עיצוב מולקולת אנטיסנס קצר.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-אקסון דילוג שימוש אנטיסנס קוקטייל של ניוון השרירים הצמוד X לכלבים

דילוג על אקסונים הוא כרגע אופציה טיפולית מבטיחה ביותר בניוון שרירים דושן (DMD). כדי להרחיב את תחולת לחולים DMD וכדי לייעל את יציבות / פונקציה של חלבונים בדיסטרופין מקוצץ וכתוצאה מכך, גישה-אקסון רב דילוג באמצעות מולקולות אנטיסנס קוקטייל פותחה הראינו הצלה בדיסטרופין מערכתית במודל הכלב.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

פקקת הברזל ותחמוצת כלוריד-induced הכלבי העורק הראשי: דגם בעל חיים גדול של פגיעה בכלי הדם

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

מדידות של המוטורית ופרמטרים אחרים התוצאה הקלינית בילדים מהיותו עם ניוון שרירים על שם דושן

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

שימוש בביופסיה כימית להערכת איכות השתל

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...