Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

エクソンスキッピングは、DMDの治療のための有望な治療技術です。 in vitroおよびin vivo実験の両方で 、マルチエクソンスキッピングが可能であることを示しています。ここで、CXMD犬モデルの使用が議論されています。 8. 2&#39;OMePS AON化学はCXMDの筋芽細胞トランスフェクションに使用し、モルフォリノAONの骨格化学は、in vivo実験のために選択した-まず、のAONは、 ジストロフィンのエクソン6を標的とするレスキュー-ESEとESEfinderプログラムを用いて設計しました。 VPMOSは変更されていないPMOをより効率的であるが、その高い毒性のために、彼らは、全身注射に適していません。 RNA抽出、RT-PCR、およびcDNA配列は、CXMD筋芽細胞で行いました。 PMOカクテルを注入したイヌは、臨床的に臨床症状の任意の改善を評価するために等級付けしました。イヌを人道的に安楽死させた後、筋肉試料を採取し、凍結切片用に調製しました。 Aによって誘導されたジストロフィンタンパク質の半減期2ヶ月 - ONを約1であると考えられています。これらの実験は新生児の犬や古い犬（&gt; 5歳）で行うことができますが、若い成犬は、本研究で使用しました。調製された筋肉切片を組織病 ​​理学を評価し、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織48を通してジストロフィンタンパク質の救助を評価しました。 PMO溶液の体積は、注射の前に正しいことを保証することが重要です。そうしないと、結果に大きな影響を持つことになります。筋肉内注射時には、十分な圧力が筋線維を入力する必要があります。犬の健康と手術部位の検査の監視、トラブルシューティングのために重要です。動物の健康を監視するには、毎週の血液検査と計量を行うべきです。動物および筋肉サンプルの調製の安楽死の後、ジストロフィンタンパク質を検出する感度を確保するための重要なステップは、トリス - 酢酸ゲル、半乾燥ブロッティング法の両方を使用することですウェスタンブロッティング手順中。 代表的な結果に示されるように、Ex6A、Ex6B、Ex8A、そしてカクテルで処理した筋芽細胞（Ex6A、Ex6B、Ex8A、およびEx8Bを含む）がインフレームDMDの製品を生産しました。 Ex8Bはないエクソンスキップされた製品を生産していないので、in vivo実験で 、後続に使用されませんでした。 DYS-2染色で9スキップ発生し、免疫細胞化学処理された試料に復元されたジストロフィン発現を示した - のcDNA配列決定は、6つのエキソンがあることを示しました。 AON処理された犬はジストロフィン陽性線維の有意な増加を示しました。 8スキップされ、短縮タンパク質が産生された - これは、エクソン6があることを示します。ジストロフィン陽性繊維の量は、AONのカクテルを使用したときに増加し、AONの用量に比例しました。イムノブロットは、全身モルホリノ処置したイヌにおけるジストロフィン発現の増加を示しました。骨格筋はジストロフィン繊維の可変レベルを有していました。しかし、モルホリノ処理された心臓組織は少しを示しましたジストロフィン発現の改善。ジストロフィンは、高分子量（427 kDaの）を有しているため、ジストロフィンの少量の検出は困難であり得ます。最良の結果を得るには、トリス - 酢酸ゲル、半乾式転写法を用いました。 HE染色は、モルホリノ処理されたイヌにおいて、改善された組織病理を示しました。中心部有核繊維（CNFの）不健康な筋肉の兆候であり、筋変性と再生のサイクルを表します。モルホリノ処置CXMD犬は、非処理CXMD犬と比較して、CNFの割合の減少を示しました。臨床グレーディングは、モルホリノ処置動物におけるこのような増加ウォーキングや実行能力のような症状の改善を、明らかにしました。筋肉の硬さは、したがって、それは格付けスキーム59に含まれていた、筋萎縮を反映すると考えられます。腿（後肢）の筋肉の硬さを評価しました。彼らはCXMDに肥大よりもむしろ萎縮を示す傾向があるので、しかし、我々は頭蓋縫工筋を除外しました。処理された犬は表示します低い等級のスコアを編と15メートル走行試験に速い時間を持っていました。 15メートルテストに改善された時間が改善された筋肉機能40を示しています。全体的により高い等級のスコアは、貧しい人々の健康と増加した筋萎縮を示しています。 これらの結果は有望であるが、マルチエクソンスキッピングは、まだ技術が臨床応用性を持って前に克服する必要があります多くの課題を提示します。心臓組織は依然としてによる心筋および骨格組織との間の細胞輸送の違いによる可能性が高い、AONの取り込みの減少が表示されます。毒性効果は、現在の投薬レジメン下の動物において観察されませんでした。 AONのカクテルの使用は、臨床試験へ移動する前にしかし、より多くの仕事は、長期の毒性を評価するために行われる必要があります。規制当局は、一意薬として各AONの配列を定義するので、AONカクテル薬の承認を得ることは困難です。これは、カクテル中の各シーケンスは、個別safetについて試験する必要があることを意味しますyは、より多くの時間とより多くのお金を必要とします。臨床の現場でのマルチエクソンスキッピングの使用に対する別の障壁は、未知の機能で生成された中間タンパク質生成物の大規模な量です。これらのタンパク質は、潜在的に、個々の突然変異22に応じて、予測できない副作用につながることができます。さらに、現在のジストロフィー犬のモデル内で利用可能な変異パターンが限られています。そこにいくつかの天然に存在する変異があり、すべての変異は、マルチエクソンスキッピングを研究するために有用ではありません。ジストロフィーのブタモデルは、将来のDMDエクソンは研究33、34をスキップするための良い代替であることを約束します。 DMDの犬のモデルは、他のDMDモデルの上にいくつかの利点を持っています。大きな動物モデル、臨床グレーディングおよびMRIであることは、より詳細な分析を可能にする、ことが可能です。犬は大型動物であるため、彼らはまた、毒性試験のために、より適しており、より密接にマウスモデルと比較して、ヒトの疾患を表します。犬メートルodelsはまた、ヒト23、34、45に類似しているDMD遺伝子配列を有します。 技術的に困難が、マルチエクソンスキッピングのアプローチは、最終的にはDMD患者24の&gt; 90％に利益を得ることができます。単一エクソンスキッピングは、患者の小さなサブセットにのみ適用されるように、これは、その単一エクソンスキッピングへのより良い代替手段になります。また、マルチエクソンスキッピングを短縮ジストロフィン蛋白質の機能を最適化し、削除パターンを選択することが可能となります。例えば、DMDのエクソンの欠失45から55は、非常に軽度の症状または無症候性の個人14,19,60-63に関連付けられています。エクソン45のマルチエクソンスキッピング- 55はすでにVPMOS 22,26の全身注射を用いて、エクソン52の欠失（mdx52）とDMDのマウスモデルで実証されています。カクテルVPMOSの使用は、例えば、筋ジストロフィーの他の形態で実証されています福山先天性筋ジストロフィー（FCMD）など。 FCMDは、異常なmRNAスプライシングは、レトロトランスポゾンの挿入によって引き起こされたエクソントラッピングによって引き起こされます。 VPMOS両方FCMDマウスモデルおよびヒト細胞系64にスプライシングパターンをレスキューすることが示されています。高い有効性と低い毒性を発揮する次世代AON​​化学は臨床応用へのマルチエクソンスキッピングアプローチの効果的な翻訳を容易にするであろう。さらに、マルチエクソンスキッピングは、潜在的にそのようなdysferlinopathies 24、65のような他の遺伝性疾患に適用することができます。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、最初の博士ギヨーム・ベンジャミン・アマンデュシェンヌ型（デブローニュ）1によって説明、進行性の筋力低下によって特徴付けられるX連鎖劣性筋疾患です。 DMDは、毎年2,3生まれた約2万影響を受けた子供たちと、全世界で約1 3500で男の子に影響を与える一般的な遺伝性疾患です。運動発達が遅れ、歩行障害を早期に十代の若者付近で車椅子の依存が続く、幼児4に見られます。死は、一般的に起因する呼吸や心不全5-8に20と30歳の間に起こります。 DMDの治療法は現在ありません。グルココルチコイドを用いた治療は、ある程度筋変性の進行を遅らせることができるが、肥満および糖尿病2,7,8を含む重大な副作用と関連します。 DMDは、機能的なジストロフィンproteiの損失につながる、 ジストロフィン （DMD）遺伝子の突然変異に起因しますn個。DMDは、200万以上の塩基対と79個のエクソン9,10に非常に大きな遺伝子です。フレーム外の突然変異につながる欠失、ナンセンス、及び重複変異は、DMD表現型の最も一般的な原因です。 9及びエクソン45 - -エクソン3領域ほとんどの患者は、DMD患者3,9,11-16に非機能的ジストロフィンをもたらす、遺伝子のこれらの部 ​​分内に欠失変異を持つように55を「突然変異ホットスポット」と呼ばれます。筋膜安定化に大きな役割を持っているジストロフィン - 糖タンパク質複合体（DGC）、内ジストロフィン機能。中央ロッドドメインはそれほど重要な役割3,9,17を果たしながら、N末端 ​​およびC末端は、機能のための最も重要なドメインです。主にDMD遺伝子内のインフレーム変異から生じるベッカー型筋ジストロフィー（BMD）、関連付けられている軽度の表現型の遵守は、DMDを治療するためのエクソンスキッピングのアプリケーションに影響を与えました。 BMD患者は短く、しかし、関数Aています末端3,6,18の両方を維持リットル、ジストロフィンタンパク質。エクソンスキッピングは、理論的には、BMD 3,19に見られるものと同様の機能短縮-しかし、ジストロフィン蛋白質で、その結果、リーディングフレームを復元することができます。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（AONは）複数の種類が2&#39;-O-メチルホスホロチオエート（2&#39;OMePS）およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMOS）を含む臨床試験において試験されてきました。これらのAONを用いてスキップエクソン51と53が検査され、結果は有望であるが、それは、変異特異3、19、20,21、22〜26であるように、単一エクソンスキッピングは、適用性を制限しています。質問はまた、単一エクソン22,23をスキップから生産結果の短縮ジストロフィン蛋白質の安定性について残ります。さらに、一部の患者は、読み枠3を回復するためにスキップする単一エクソン以上が必要です。技術的にはより困難にしながら、マルチエクソンスキッピングは、1つの方法であることこれらの問題3,19に対処することができます。マルチエクソンスキッピングは、以前ジストロフィー犬及びインビトロでのヒト細胞系において実証されています。さらに、mdx52マウスおよびイヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）犬のモデルは、生体内に使用されてきた22、24-27を研究しています。犬X連鎖筋ジストロフィー日本（CXMD J）CXMD Jのリーディングフレームがエクソン6,8、または追加のエクソン（ 例えば 、エクソンは、3から9）のマルチエクソンスキッピングによって復元することができるようビーグル犬は、ここで使用された（ 図1）。ビーグルベースCXMDはゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（GRMD）モデルと同じ変異パターンを共有するが、ビーグル犬は、このようにDMD 28,29のための有用なモデルを提供し、それらの体の大きさに維持するために小型で安価です。 CXMD犬は、より密接に齧歯類のように、小さい動物モデルよりも人間のDMD表現型を模倣する、と毒物学的評価3,22,30,31のために、より信頼性が高いです</s（ 図2）&gt;アップ。 CXMD犬は、DMDに見られるものと類似の漸進的筋崩壊、歩行障害、心臓や呼吸器系の問題を表示します。単一エクソンスキッピングと比較して、マルチエクソンスキッピングは、患者のはるかに大きな割合にも適用可能です。最も一般的な3つの変異型（欠失、ナンセンス、および重複）のうち、80 -すべてのDMD患者の45％は特にエクソン45をスキップしてから利益を得ることができる一方で、患者の98％は、14,32,33をスキップするマルチエクソンを通じて治療することができます- 55 3,19,22,34。 修正されたモルフォリノの発展に伴い、エクソンスキッピングを容易にAONカクテルの効率が向上しました。アルギニンリッチ細胞透過性ペプチドコンジュゲートのPMO（PPMOs）、およびin vivo-モルフォリノ（VPMOS）が有意に細胞透過性と安定性3,35-38が改善されたAONの化学的性質です。懸念は、長期的AON毒性について残ります。しかし、重要な進展なされています。モルフォリノに作られた化学修飾を大幅にオフターゲット効果を減少させ、前臨床研究では、有意な毒性作用3,22,39,40を報告しませんでした。マルチエクソンスキッピングのための残りの課題は、各単一AONの現在の要件はカクテル3,19,22,41,42としての代わりに、一緒に、単一の薬剤として、単独の毒性について試験されます。シングルと心をターゲットに飛びマルチエクソンの両方を含むDMDの研究では、ジストロフィー心臓組織でほとんど改善がありました。心臓内のモルフォリノの有効性は乏しいため、細胞透過性能力の低いものと考えられています。ペプチド結合PPMOs心臓3,19,38にレスキュー機能性ジストロフィンタンパク質の量を増加させる、心臓細胞に浸透するAONの能力を改善しています。 ここでは、私たちのAONカクテルアプローチはESEfinderソフトウェア43を使用してAON配列の設計を含め、長さで議論されています。 Protocマルチエクソンスキッピングと犬の実験のためのオールも記載されています。 CXMD Jのビーグル犬は、エキソン6,8スキップ実験に使用しました。 CXMD犬モデルでスキッピングマルチエクソンは、有望な結果を示しているが、課題は、彼らが臨床的に適用される前に、その必要性が克服されずに残っています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）はジストロフィン （DMD）遺伝子の突然変異によって引き起こされる、世界的に最も一般的な致死性の遺伝性疾患の一つです。エクソンスキッピングはリーディングフレームを復元し、短いが、機能性タンパク質を産生するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AONは）と呼ばれる短いDNA / RNA様分子を採用しています。 （単一AON薬で治療することができる患者のわずか13％まで）限定された適用性、および短縮型タンパク質の不確かな機能：しかし、エクソンスキッピング治療は、2つの主要なハードルに直面しています。これらの問題は、カクテルAONのアプローチで対処されました。 DMD患者の約70％が単一エクソンスキッピングにより（結合されたすべてのエキソン）で処理することができるがカクテルアンチセンス薬剤を使用してスキップ複数のエクソンを実現することができる場合、一方は、潜在的にDMD患者の90％以上を治療することができました。イヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）犬のモデル、その表現型人間のDMD患者に、より似ているが、全身efficを試験するために使用しましたエクソン6と8のマルチエクソンスキッピングのACYと安全性がCXMD犬のモデルは、 ジストロフィン mRNAにおけるエクソン7の欠如につながる、イントロン6のスプライス部位突然変異を保有します。 CXMDに読み枠を復元するには、エクソン6と8のマルチエクソンスキッピングが必要です。したがって、CXMDは、マルチエクソンスキッピングの有効性と安全性をテストするための良い中型動物モデルです。現在の研究では、エクソン6及びエクソン8を標的とするアンチセンスモルホリノのカクテルを設計した、それは身体全体の骨格筋でジストロフィン式を復元しました。 CXMD犬モデルでカクテルオリゴとマルチエクソンスキッピングの有効性と安全性の評価のトランスフェクション/注入するための方法が提示されています。

インビトロ実験で 筋芽細胞は、各AONの有効性を比較するために、様々な2&#39;OMePS処理条件を用いてトランスフェクトしました。 600 nMのEx6A、Ex6B、Ex8A、またはEx8Bのそれぞれと単一AON処理は、600 nMのすべての4 AONの配列の各々でのカクテル治療と同様に、行われました。 RNAサンプルを、トランスフェクションの4日後に採取しました。 RT-PCR後、各治療のためのサンプルは、非処置（NT）のサンプルと一緒にゲルに流しました。ゲル上の高いバンドは、アウトオブフレームDMDの製品を表します。これらのバンドは、NT、Ex8Aで見られた、とEx8Bは筋芽細胞を処理しました。 Ex6A、Ex6B、Ex8A、そしてカクテルで処理した筋芽細胞は、インフレームの製品を示しました。 Ex8Aはインフレーム製品（ 図7）のみ30％を示したカクテルとEx6A / Bは、インフレームの製品100％を示しました。エクソンスキッピングとの復元を確認するために、リーディングフレームは、cDNAの配列決定を行いました。 9実際に（ 図7）はスキップされていた-結果は、エクソン6があることが示されました。免疫組織化学は、AON処理された犬はNTサンプル（ 図8）と比較して、ジストロフィン陽性線維が増加したことを示しました。 in vivo 実験 様々なAON処理条件の効率を比較するために、CXMD犬（0.5から5歳）は1.2 mgのEx6Aまたは様々な用量でEx6A、Ex6B、およびEx8Aのカクテルで一回注射しました。二週間注射後、筋肉試料を集め、ジストロフィン陽性線維の数を比較するDYS-1で染色しました。全てのカクテルで処理したサンプルは、NTのサンプルと比較して増加したジストロフィン発現を示しました。ジストロフィン陽性繊維は、AONの投与量（ 図9）と増加しました。次のシステムIC注射、野生型（WT）、NT、およびカクテル処置CXMD筋肉試料をDYS-1（ 図10）を用いて染色しました。カクテルで処理したCXMD犬は、CTや心臓の筋肉サンプルの両方のNT CXMD犬、と比較して増加ジストロフィン発現を示しました。しかしながら、AON処理した骨格筋（CT）は、処理された心筋に比べジストロフィンの非常に高い発現を示しました。 WT、NT、および様々なモルホリノカクテルで処理した筋肉を比較するイムノブロットは、同じ結論に至りました。処理された骨格筋サンプルにおけるジストロフィン発現の大規模な範囲は、（ 図10）もありました。ヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）染色は、CXMDをあしらったことを明らかにしました 犬はNT CXMD犬（ 図11）と比較して中央に有核繊維（CNF）の有意な減少で、改善された組織病 ​​理を示しました。これは、NTの犬で発生した複数の変性/再生、ジストロフィー筋病理の兆候があることを示します。さらに、処理された犬は速くていました臨床評価スケールで時間と改善されたスコアを実行しています。処理されたCXMD犬はすべてのカテゴリでNT CXMD犬（ 図12）よりも良好なスコアを示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> CXMD犬とエキソン6の図1.変異パターン- 。アンチセンスカクテルを使用した8スキップ戦略 CXMD犬は、ジストロフィー犬mRNAにおけるエクソン7の損失につながるエクソン6における点変異を持っています。これはmRNAがアウトオブフレームであるとジストロフィンタンパク質の産生が失われることになります。 AONカクテルで処理されたイヌの灰色のバーが短いAONシーケンスを表す8 - ショートAON配列が効果的に6個のエクソンをスキップmRNAスプライシングをもたらす6,8を、エクソンに結合するように設計されています。エクソン9は、ヒンジドメインをコードし、時には自然に短くなっているタンパク質が、機能ジストロフィンのためのエクソン6,8に対してのAONで得られたmRNAのコードをスプライシングされますal。は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> 1歳のイヌX連鎖筋ジストロフィー（CXMD）動物の図2.主な臨床症状。1歳の野生型ビーグルとCXMD犬が示されています。近位、四肢、および一時的な筋肉の関与は通常、生後2ヶ月から観察されています。共同拘縮や骨盤のずれは、生後4ヶ月から顕性である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> 犬。A）Intramuscul図3.全身麻酔arの注射と筋肉生検をイソフルランで全身麻酔下で行われています。 B）全身注射のための動物の開催。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> 図4.磁気共鳴イメージング野生型の（MRI）、CXMD非処理、および WTおよびNT CXMD犬に3ヶ月と5ヶ月で後肢のCXMD。MRIスキャンを処理しました 。 AONのポスト噴射（最初の注射の前に1週間）で処理CXMD後肢MRIの前の2つのサンプル画像が表示されます。 2703MAは200ミリグラム/キログラムカクテルモルフォリノで7倍毎週処理しました。 2001MA 120ミリグラム/ kgのカクテルモルホリノの5X毎週のIV注射で処理しました。対照および処理の犬は、年齢をマッチさせました。処理された犬は減少T2信号を示しています。画像はADAPです<html>横田らの許可を受けてテッド。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> 犬のための図5.筋肉生検手順。A）下肢が筋生検のために固定されています。 B）鉗子の助けを借りて、下肢が保持されています。 C）CTの筋肉を露出させます。開放生検技術は、注入部位の筋肉サンプルを得るために使用されます。スレッドは、生検試料を保持するために使用されています。解剖後トラガカントゴム上D）筋サンプル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; 図6.セミドライ転送方式。ウェスタンブロッティング用のセミドライ転写法の表現が提示されています。濃縮された陽極バッファーに浸した3つの論文は、負端子に敷設されています。陽極緩衝液に浸漬した3論文は、この上に積層されています。 MbのPVDF紙6紙の上に置かれる前に、メタノール、次いで、陽極緩衝液に浸漬されています。カソードバッファー中に浸漬されたゲルを、PVDF紙の上に静かに置かれます。最後に、陰極バッファーに浸し3論文は、ゲルの上部に配置されています。正端子は上に設定されています。 1時間、400ミリアンペアは、システムを介して実行されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> 図7. CXMD筋芽細胞におけるエクソンスキッピング。 </stチョロン&gt; CXMDの筋芽細胞はEx6A、Ex6B、Ex8A、または単独でEx8B、またはすべての4のカクテルでトランスフェクトしました。 600 nMの合計は、個々の配列のために使用し、カクテル、各配列の600 nMで使用しました。 A）CXMD犬の筋芽細胞で治療を2&#39;OMePS。 Ex6A、Ex6B、そしてカクテルで処理したサンプルは、インフレームエクソン・スキップ転写産物の予想される位置での強いバンドを示します。 Ex8AはEx8Bが弱いバンドを示し、中間バンドを示し、およびNTは、インフレームの位置にバンドが表示されません。単独Ex6Aから、4日間トランスフェクション後B）のcDNA配列決定。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> 図8.増加Dystrop2&#39;-O-メチルホスホロチオエート（2&#39;OMePS）トランスフェCXMD筋芽細胞に発現しホアヒン。CXMD筋芽細胞を単独でEx6Aまたはカクテル2&#39;OMePSをトランスフェクトしました。 DYS-2（赤色）及びDAPI（青）染色を示します。処理された筋芽細胞は、野生型（WT）および非処理（NT）筋芽細胞と比較されます。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> CXMD犬のモルフォリノの筋肉内注射でジストロフィン発現の図9.レスキュー。単独Ex6AまたはEx6A、Ex6B、およびEx8Aのカクテルは、CXMD犬のCTの筋肉に注射しました。野生型のジストロフィン（DSY-1）染色（WT）、無処理（NT）、およびCXMD犬が示されている処理されました。犬は単独で1.2ミリグラムのEx6Aまたは1.2 mgのカクテルで処理しました。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> CXMD犬。ジストロフィンにおける全身カクテルモルホリノ治療 （DYS-1）の後 、 図10の増加ジストロフィン発現は染色は、（NT）（陰性対照）、無処理、野生型（WT）（陽性対照）でジストロフィンの発現を比較するために使用されました120ミリグラム/ kgのモルホリノカクテル（各AONを40mg / kg）で処理し、CXMD犬。モルホリノカクテルはEx6A、Ex6B、およびEx8Aを含んでいました。犬は、静脈内に5回注射した私たちこのカクテルでekly。 A）ジストロフィンWT、NTの頭蓋脛骨（CT）の筋肉内での発現、および処理された犬との比較。 B）NTおよびモルホリノカクテルで処理された犬との間に心臓組織におけるジストロフィン発現の比較。ローディングコントロールとしてデスミンとジストロフィンのためのC）イムノ​​ブロットは、WT、NT、およびモルホリノカクテルで処理された犬のために示されています。以下の筋肉が処理された犬のために示されている：上腕三頭（TB）、上腕二頭筋（BB）、ダイヤフラム（DIA）、食道（ESO）、CT、内転筋（ADD）、長指伸筋（EDL）、咬筋（MAS）、そして、心。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。バー=200μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> フィギュア11. CXMD犬における組織病 ​​理240ミリグラム/キログラムモルホリノカクテルで7週間処理の改善。一度半年から5歳までのCXMD犬が240ミリグラム/キログラムモルホリノカクテル（Ex6A、Ex6B、およびEx8A）を静脈内注射しました7週間の週。 14日最後の注射後に、食道の筋肉を採取し、ヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）染色を行いました。 HEの非処理（NT）から食道の筋肉の染色およびモルホリノカクテルで処理した（処理された）CXMD犬（40X対物レンズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> 図12は、臨床成績評価のスコアを改善し、15メートルは、モルホリノ処理後の時間を実行している。モルホリノ処理された犬は、非処理（NT）同腹仔と比較しました秒。グラフ中のエラーバーはSEMを示します。 A）は、臨床グレーディング試験で合計スコアが治療前と後に計算し、処理した動物NT同腹子と比較しました。 B）で処理し、NT犬の15メートル走行時間の比較。 Bと同様にC）;しかし、若い犬を使用しました。画像は横田らからの許可を得て適応されます。（著作権2009年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）40。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> アンチセンスオリゴヌクレオチド </td><td> ヌクレオチド配列 </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> 表1アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計。

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

エクソンスキッピングは、現在、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のための最も有望な治療選択肢です。 DMD患者のための適用性を拡大し、切り捨てられジストロフィン蛋白質の安定性/機能を最適化するために、カクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いたマルチエクソンスキッピングアプローチが開発された、我々は犬のモデルで全身ジストロフィンの救助を実証しました。

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

ビボ犬筋肉の機能アッセイに

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

塩化第二鉄によるイヌ総頚動脈血栓症: 血管損傷の大動物モデル

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

運動機能、デュシェンヌ型筋ジストロフィー児の外来の他の臨床パラメーターの測定

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

移植質評価のための化学バイオプシーの使用

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してスキップ