Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

엑손 스키핑은 DMD의 치료를위한 유망한 치료 기술이다. 모두 시험 관내 및 생체 내 실험에서 멀티 엑손 스킵이 가능한 것으로 나타났다. 여기서, CXMD 개 모델의 사용이 설명되어 있습니다. 2&#39;OMePS AON 화학은 CXMD의 근원 세포의 형질 전환 및 모르 폴리 노의 AON 백본 화학 생체 실험을 위해 선택되었다에 사용 된 8 - 첫째, AONs는 디스트로핀의 엑손 (6)를 대상으로 구조-ESE 및 ESEfinder 프로그램을 사용하여 설계되었다. vPMOs는 수정되지 않은 PMOS보다 더 효율적이지만 그들의 높은 독성으로 인해 그들은 전신 주사에 적합하지 않습니다. RNA 추출, RT-PCR 및 cDNA의 염기 서열은 CXMD의 아세포상에서 수행 하였다. PMO 칵테일 주사 개는 임상 증상에 어떤 개선을 평가하는 임상 등급 화했다. 개는 인도적으로 안락사시킨 후, 근육 샘플 촬영 및 극저온 절편을 준비 하였다. A로 유도 디스트로핀 단백질의 반감기2개월 - 기능은 약 1로 여겨지고 있습니다. 이 실험은 신생아 개 (5 세&gt;) 이전 개를 사용하여 수행 할 수 있지만 젊은 성인 개는이 연구에 사용되었다. 준비 근육 섹션은 조직 병리학을 평가하고 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학 (48)를 통해 디스트로핀 단백질 구조를 평가하기 위해 사용되었다. PMO 용액의 부피가 주입 전에 올바른지 확인하는 것이 중요하다; 그렇지 않을 경우 결과에 상당한 영향을 미칠 것입니다. 근육 주사 동안, 충분한 압력이 근육 섬유를 입력 할 필요가있다. 개 건강과 수술 부위의 검사 모니터링은 문제 해결을 위해 중요하다. 동물의 상태를 모니터링하기 위해, 매주 혈액 검사와 무게가 수행해야합니다. 동물 근육 샘플 준비 euthanization 후, 디스트로핀 단백질의 검출 감도를 확보하기위한 중요한 단계는 트리스 - 아세테이트 젤, 세미 드라이 블롯 방법 모두를 사용하는웨스턴 블로 팅 절차를 수행하는 동안. 대표적인 결과에 도시 된 바와 같이, 근육 아세포는 프레임 내 DMD 제품 제조 Ex6A, Ex6B, Ex8A 및 칵테일 (Ex6A, Ex6B, Ex8A 함유하고 Ex8B)로 처리 하였다. Ex8B 더 엑손 스킵 제품을 생성하지 않기 때문에, 이는 생체 내 실험에서 이후에 사용되지 않았다. 9 건너 뛰기 발생한 DYS-2 염색과 면역 세포 치료 샘플에서 디스트로핀 식을 복원 보였다 - cDNA의 염기 서열은 엑손 6 것으로 나타났다. AON 처리 된 개는 디스트로핀 양성 섬유의 상당한 증가를 나타내었다. 8 생략되고하고 단축 단백질이 생성되었다 -이 엑손 6가 있음을 나타냅니다. 디스트로핀 양성 섬유의 양은 AONs의 칵테일을 사용했을 때 증가 AON 투여 량에 비례 하였다. 면역 블롯은 전신 모르 폴리 노 처리 개에서 디스트로핀의 발현을 증가 보였다. 골격근은 디스트로핀 섬유의 가변 레벨을 가지고; 그러나, 모르 폴리 노 - 처리 된 심장 조직이 약간 보였다디스트로핀 발현의 향상. 디스트로핀은 높은 분자량 (427 kDa의)을 갖기 때문에, 디스트로핀 소량의 검출이 어려울 수있다. 최상의 결과를 위해, 트리스 - 아세테이트 겔 및 세미 드라이 전사 방법을 사용 하였다. 그는 모르 폴리 노 처리 강아지의 개선 조직 병리학을 보였다의 염색. 중앙 핵 섬유 (CNFs)는 건강에 해로운 근육의 표시이며, 근육의 변성과 재생의주기를 나타냅니다. 모르 폴리 노 - 처리 CXMD 개는 비 처리 CXMD 개 비교 CNFs의 비율의 감소를 보였다. 임상 등급은 모르 폴리 노 처리 된 동물에서 증가 산책과 실행 능력과 같은 증상의 개선을 밝혔다. 근육의 경도 따라서,이 등급 체계 (59)에 포함 된 근육 위축을 반영하는 것으로 생각된다. 대퇴부 (뒷다리) 근육의 경도를 평가 하였다; 그들은 CXMD에 비대보다는 위축을 나타내는 경향이 있기 때문에, 우리는 뇌 SARTORIUS 근육을 제외. 치료 개 표시낮은 등급의 점수를 에드와 15m 주행 시험에 빠른 시간을 가졌다. 15m 시험에 개선 된 시간은 개선 된 근육 기능 (40)을 나타내는입니다. 높은 전체 등급 점수는 건강이 좋지 증가 근육의 위축을 나타냅니다. 이러한 결과는 유망하지만, 멀티 - 엑손 스킵 여전히 임상 기술을 적용하기 전에 극복해야 할 많은 과제를 제시한다. 심장 조직은 여전히​​ 인해 심장과 골격 조직 사이의 세포 인신 매매의 차이로 AONs, 가능성의 감소 흡수를 표시합니다. 독성 효과는 현재 투여 섭생하에 동물에서 관찰되지 않았다; AON 칵테일의 사용은 임상 시험으로 이동하기 전에 그러나, 많은 작업 장기 독성을 평가하기 위해 수행 할 필요가있다. 규제 기관 고유 약물 각 AON 순서를 정의하기 때문에 AON 칵테일 약물에 대한 승인을 얻기 어렵다. 이 칵테일의 각 시퀀스는 개별적으로 보안 시스템을 테스트 할 필요가 있음을 의미Y는 더 많은 시간과 더 많은 돈을 요구. 임상 환경에서 멀티 엑손 스킵를 사용하는 또 다른 장벽 미지 함수 생성 중간 단백질 제품의 많은 양이다. 이 단백질은 잠재적으로 개인 돌연변이 (22)에 따라 예측할 수없는 부작용을 초래할 수 있습니다. 또한, 현재의 이영 개 모델에서 사용 가능한 돌연변이 패턴이 제한됩니다. 이 몇 자연 발생적인 돌연변이가 있고, 모든 돌연변이는 멀티 엑손 스키핑을 연구하는 데 유용하지. 이영 돼지 모델은 미래의 DMD 엑손은 연구 33, 34을 건너 뛰는에 대한 좋은 대안이 될 것을 약속드립니다. DMD 개 모델은 다른 DMD의 모델에 비해 몇 가지 장점이있다. 더 큰 동물 모델 임상 등급 인 및 MRI보다 자세한 분석을 위해 허용 가능하다. 개는 큰 동물이기 때문에 그들은 또한 독성 연구에 더 적합하고 더 밀접하게 마우스 모델에 비해 인간의 질병을 나타냅니다. 개 models 또한 인간 23, 34, 45에 더 유사하다 DMD 유전자 서열을 가지고있다. 기술적 도전이지만, 멀티 엑손 스킵 방식은 궁극적 DMD 환자 24&gt; 90 % 유익 할 수있다. 단일 엑손 스키핑 환자의 작은 부분 집합에만 적용 이것은, 그것은 단일 엑손 스키핑에 더 나은 대안이 있습니다. 또한, 멀티 - 엑손 스키핑은 단축 디스트로핀 단백질의 기능을 최적화 삭제 패턴을 선택하기 위해 사용된다. (55) 매우 가벼운 증상 또는 무증상 개인 14,19,60-63와 관련된 - 예를 들어, DMD의 삭제는 45 엑손. 엑손 (45)의 멀티 - 엑손 스킵 - 55 이미 vPMOs 22,26 전신 주사를 사용하여 엑손 52 삭제 (mdx52)과 DMD의 마우스 모델에서 입증되었다. 칵테일 vPMOs의 사용은 또한 근이영양증 다른 형태의 예에서 설명 된후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD) 등. FCMD은 비정상적인 mRNA의 접합이 레트로 트랜스포존의 삽입으로 인해 발생하는 엑손 트래핑에 의해 발생합니다. vPMOs는 둘 다 FCMD 마우스 모델과 인간 세포주 (64)의 접합 패턴을 구하기 위해 도시되었다. 높은 효능과 낮은 독성을 나타내는 차세대 AON 화학 임상 응용에 멀티 엑손 스킵 방식의 효과적인 번역을 용이하게한다. 또한, 멀티 - 엑손 스킵 잠재적 예 dysferlinopathies 24, 65 등의 다른 유전 질환에 적용 할 수있다.

뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD) 먼저 박사 기욤 - 벤자민 - AMAND 뒤 시엔 느 (드 불로뉴 1)에 의해 설명 진보적 인 근육 약화 특징으로하는 X 연결된 열성 근육 질환이다. DMD는 매년 2,3 태어난 약 2 만 영향을받는 아이들과 함께, 전 세계적으로 약 1 3,500에서 소년에 영향을 미치는 일반적인 유전 질환이다. 모터 개발이 지연되고, 보행 장애는 초기 청소년에 대한에 휠체어 의존성 다음에, 유아 (4)에서 볼 수 있습니다. 죽음은 일반적으로 인한 호흡이나 심장 장애 5-8 20 30 세 사이에 발생합니다. DMD에 대한 치료법은 없습니다. 글루코 코르티코이드로 처리하고 어느 정도의 근육 퇴행의 진행을 느리게 할 수 있지만, 비만 및 당뇨병 2,7,8 포함한 심각한 부작용과 관련된다. DMD는 기능 디스트로핀의 PROTEI의 손실로 이어지는은 디스트로핀 (DMD) 유전자에 돌연변이의 결과n은. DMD는 2 백만 염기쌍 79 엑손 9, 10으로 매우 큰 유전자이다. 아웃 오브 프레임 돌연변이로 이어지는 삭제, 넌센스, 및 중복 돌연변이는 DMD 표현형의 가장 흔한 원인이다. 9 엑손 (45) - - 엑손 3의 지역 대부분의 환자는 유전자의 이러한 부분에서 삭제 돌연변이를 가지고 55 DMD 환자 3,9,11-16에 비 기능 디스트로핀을 선도, &quot;돌연변이 핫스팟&quot;이라고한다. 근육 세포막의 안정화에서 중요한 역할을 갖는 디스트로핀 당단백 복합체 (DGC) 내의 디스트로핀 기능한다. 중앙로드 도메인이 덜 중요한 역할을한다 3,9,17하면서 N- 말단 및 C는 함수의 가장 중요한 영역이다. 주로 DMD 유전자 내의 프레임 내 돌연변이의 결과 베커 근이영양증 (BMD)과 연관된 경증 표현형의 준수는 DMD의 치료 스킵 엑손의 적용을 고무. BMD 환자는 단축하지만 functiona 한말단 3,6,18 모두를 유지 리터, 디스트로핀 단백질. 엑손 스킵 이론적 BMD 3,19에서 보이는 것과 유사한 단축-하지만 관능 디스트로핀 단백질의 결과로, 판독 프레임을 복원 할 수있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (AONs)의 여러 유형 2&#39;O - 메틸화 포스 포로 (2&#39;OMePS) 및 phosphorodiamidate의 모르 폴리 노 올리고머 (PMOS)를 포함하여 임상 시험에서 테스트되었습니다. 이 AONs를 사용하여 건너 뛰기 엑손 (51) 및 (53)는 조사 된 결과가 유망한 동안 돌연변이 별 3, 19, 20, 21, 22 ~ 26대로, 단일 엑손 스키핑은 적용이 제한되어 있습니다. 질문은 하나의 엑손이 22, 23 스킵로부터 생성 된 결과적인 단축 디스트로핀 단백질의 안정성에 대해 남아있다. 또한, 일부 환자는 하나의 엑손보다가 독서 프레임 (3)을 복원하기 위해 제외 될 필요합니다. 기술적으로 더 어려운 반면, 멀티 엑손 스키핑은 하나의 방법입니다이러한 문제 3,19를 해결할 수 있습니다. 멀티 엑손 스키핑 이전 이영 개, 시험관에서 인간 세포주에서 입증되었다. 또한, mdx52 마우스와 개 X-연결 근이영양증 (CXMD) 개 모델에서 생체에 사용 된 22, 24 ~ 27을 연구. 송곳니 X 결합 근이영양증 (일본 CXMD J) CXMD J의 판독 프레임은 엑손 (6, 8) 또는 추가 엑손 (즉, 엑손은 3-9)의 멀티 엑손 스킵에 의해 복원 될 수있는 비글 여기에 사용 하였다 (도 1). 비글 기반 CXMD는 골든 리트리버 근이영양증 (GRMD) 모델과 동일한 변이 패턴을 공유하지만 비글 견 따라서 DMD (28, 29)에 유용한 모델을 제공하기 때문에 자신의 신체 크기에 작은 및 유지 관리를 저렴합니다. CXMD 개는 더 밀접하게 설치류 같은 작은 동물 모델보다 인간의 DMD 표현형을 모방, 및 독성 학적 평가 3,22,30,31을 더 신뢰할 수있는 </s(그림 2)&gt;입니다. CXMD 개는 DMD에서 본 것과 유사한 진보적 인 근육의 붕괴, 보행 장애, 심장 및 호흡기 문제를 표시합니다. 단일 엑손 스킵과 비교하여 멀티 - 엑손 스키핑 환자의 더 큰 비율에 적용 가능하다. 가장 일반적인 세 돌연변이 유형 (삭제, 넌센스, 및 중복) 중 80 - 모든 DMD 환자의 45 %가 이익을 얻을 수있는 동안 환자의 98 %는 구체적으로 건너 뛰는 엑손 (45), 멀티 엑손은 14,32,33를 건너 뛰는를 통해 처리 될 수있다 - 55 3,19,22,34. 변성 morpholinos의 발달로, 엑손 스킵 촉진에 AON 칵테일의 효율이 개선되었다. 아르기닌이 풍부한 세포 침투 펩타이드 결합 된 PMOS (PPMOs), 및 생체-morpholinos (vPMOs)은 크게 세포 침투 능력과 안정성 3,35-38을 향상 AON 화학이다. 우려는 장기 AON 독성에 대한 유지; 그러나, 상당한 진전만들어졌다. morpholinos에 대한 화학 수정은 크게 오프 대상 효과를 감소 및 사전 임상 연구는 유의 한 독성 효과 3,22,39,40을보고있다. 멀티 엑손 스키핑을위한 남은 과제는 각각의 단일 AON의 현재 요구 사항 칵테일 3,19,22,41,42으로 대신 함께 하나의 약물로, 단독으로 독성 시험을하여야한다. 심장을 대상으로 스킵 핑 하나 모두 다 엑손을 포함하는 DMD의 연구에서, 이영 심장 조직에 약간의 개선이 있었다. 마음에 morpholinos의 효능 때문에 가난한 세포 침투 능력이 낮은 것으로 생각된다. 펩타이드 공액 PPMOs 심장 3,19,38에 기능성 구조 디스트로핀 단백질의 양을 증가, 심장 세포 침투 AONs의 능력을 개선하고있다. 여기서, 우리 AON 칵테일 접근법 ESEfinder 소프트웨어 (43)를 사용 AON 서열의 설계를 포함하여 길이로 논의된다. Protoc멀티 엑손 스키핑와 개 실험에 대한 OLS도 설명되어 있습니다. CXMD J의 비글 견은 엑손 6, 8 스킵 실험에 사용 하였다. CXMD 개 모델에서 건너 뛰는 멀티 엑손은 유망한 결과를 보여 주지만, 문제는 임상 적으로 적용 할 수 있습니다 전에 필요가 극복해야 할 남아있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD)는 전세계 디스트로핀 (DMD) 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 가장 흔한 유전 치명적인 질환이다. 엑손 스키핑은 독서 프레임을 복원하고 짧은하지만 기능적인 단백질을 생산 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (AONs)라는 짧은 DNA / RNA와 같은 분자를 사용한다. (하나의 AON 약물로 치료 될 수있는 환자의 13 %까지) 제한 적용하고, 절단 된 단백질의 불확실 기능 : 그러나, 엑손 건너 뛰는 치료는 두 가지 주요 장애물에 직면 해있다. 이러한 문제는 칵테일 AON 방식으로 해결했다. DMD 환자의 약 70 %가 단일 엑손 스킵하여 (결합 모두 엑손)로 처리 할 수​​ 있지만 칵테일 안티센스 약물을 이용하여 스킵 여러 엑손이 실현 될 수 있다면, 하나의 잠재적 DMD 환자의 90 % 이상을 치료할 수있다. 송곳니의 X-연결 근​​이영양증 (CXMD) 개 모델, 그 표현형 인간의 DMD 환자에 더 유사하다는 전신 effic을 테스트하는 데 사용 된ACY과 엑손 6, 8 CXMD 개 모델의 멀티 엑손 스키핑의 안전 디스트로핀의 mRNA의 엑손 7의 부족으로 이어지는, 인트론 6 스플 라이스 사이트 변이를 항구. CXMD에서 독서 프레임을 복원하려면 엑손 6, 8의 멀티 엑손 스키핑이 필요합니다; 따라서, CXMD 멀티 엑손 스키핑의 효능과 안전성을 테스트하기위한 좋은 중간 크기의 동물 모델이다. 현재의 연구에서, 엑손 6 엑손 (8)을 대상으로 안티센스 morpholinos의 칵테일 설계되었으며 그것은 몸 전체의 골격 근육 디스트로핀 식을 복원. 형질 전환 / 칵테일 올리고 주입과 효능 및 CXMD 개 모델에서 멀티 엑손 스키핑의 안전성 평가를위한 방법을 제시한다.

생체 외 실험에서 아세포는 각 AON의 효과를 비교하기 위해 다양한 2&#39;OMePS 처리 조건과 함께 형질 감염시켰다. 600 nm의 Ex6A, Ex6B, Ex8A, 또는 Ex8B 각각의 단일 AON 치료는 600 nm의 4 AON 시퀀스의 각각 칵테일 치료뿐만 아니라, 수행되었다. RNA 샘플은 사일 형질 전환 후 수집 하였다. RT-PCR 후, 각각의 처리를위한 샘플은 미처리 (NT) 시료와 함께 겔상에서 실행 하였다. 겔에 더 높은 밴드는 아웃 오브 프레임 DMD 제품을 나타냅니다; 이 밴드는 NT, Ex8A에서 볼되었고, Ex8B는 근육 아세포를 처리 하였다. Ex6A, Ex6B, Ex8A 및 칵테일 처리 된 근육 아세포는에서 프레임 제품을 보여 주었다. Ex8A 단지 30 %의 프레임 제품을 (도 7)을 보였다 칵테일 및 Ex6A / B는 100 %의 프레임의 제품을 나타내었다. 엑손 스키핑 및 복원을 확인하려면판독 프레임은, cDNA의 서열 분석을 실시 하였다; 9 사실 (도 7) 스킵되었던 - 결과가 엑손 6 것으로 나타났다. 면역은 AON 처리 개는 NT 샘플 (그림 8)에 비해 디스트로핀 양성 섬유를 증가했던 것으로 나타났다. 생체 실험에서 다양한 AON 처리 조건의 효율성을 비교하기 위해, CXMD 개 (0.5-5 세) 1.2 mg을 Ex6A 또는 다양한 용량에서 Ex6A, Ex6B 및 Ex8A의 칵테일 한 번 주사 하였다. 2 주 후, 주입, 근육 시료를 수집하고, 디스트로핀 양성 섬유의 수를 비교 DYS-1 염색. 모든 칵테일 처리 된 샘플은 NT 샘플에 비해 증가 디스트로핀 발현을 보였다. 디스트로핀 양성 섬유는 AON 투여 (그림 9) 증가 하였다. 다음과 같은 시스템IC 주입은, 야생형 (WT), NT, 칵테일 처리 CXMD 근육 샘플 DYS-1 (도 10)으로 염색 하였다. 칵테일 처리 CXMD 개는 CT와 심장 근육 샘플 모두, NT CXMD 개에 비해 디스트로핀의 발현을 증가 보였다. 그러나, AON 처리 골격근 (CT)의 처리에 비하여 심근 디스트로핀의 더 높은 발현을 보였다. WT, NT, 다양한 모르 폴리 노 칵테일 처리 된 근육을 비교 면역이 같은 결론을 이끌어 냈다. 처리 된 골격 근육 샘플에서 디스트로핀 식의 큰 범위는 (그림 10)도 있었다. 헤 마톡 실린 및 에오신 (HE) 염색 CXMD를 ​​처리 한 것으로 나타났다 NT 개 CXMD 개 (도 11)에 비해 중앙 핵 섬유 (CNF)의 상당한 감소와 개선 된 병리를 보였다. 이것은 NT 개에서 발생하는 더 퇴보 / 재생, 이영 근육 병리의 표시가 나타냅니다. 또한, 처리 개는 빨리했다임상 등급 규모에 배 향상된 점수를 실행할 수 있습니다. 치료 CXMD 개는 모든 범주에서 NT CXMD 개 (그림 12)보다 더 나은 점수를 보였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> CXMD 강아지와 엑손 6 그림 1. 돌연변이 패턴 -. 안티센스 칵테일을 사용하여 8 건너 뛰기 전략 CXMD 개는 이영 개의 mRNA의 엑손 7의 손실로 이어지는 엑손 6의 점 돌연변이가있다. 이 mRNA를 분실 아웃 오브 프레임과 디스트로핀 단백질 생산되는 결과. AON 칵테일 처리 개에 회색 막대가 짧은 AON 시퀀스를 나타내는 8 - 짧은 AON 서열은 효과적으로 6 엑손을 건너 뛰는 mRNA의 접합 결과 6, 8, 엑손에 결합하도록 설계되었습니다. 엑손 9는 힌지 도메인을 코딩 때로는 자발적 짧은 단백질이지만 함수 디스트로핀위한 엑손 6 및도 8에 대해 AONs 얻어진 mRNA의 코드를 접합되고알은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> 1 세 개 X-연결된 근육 영양 장애 (CXMD) 동물 그림 2. 주요 임상 증상. 1 년 된 야생 형 비글과 CXMD 개 표시됩니다. 근위, 사지, 시간적 근육의 참여는 일반적으로 세 2 개월에서 관찰된다. 공동 구축 및 골반의 이동이 세 4 개월 명백한입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> ) Intramuscul 개. A에 대한 그림 3. 전신 마취아칸소 주사 및 근육 생검은 이소 플루 란과 전신 마취하에 수행됩니다. B) 전신 주사에 대한 동물의 들고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> 야생형도 4의 자기 공명 영상 (MRI)을 CXMD 비 처리 및 CXMD를 처리 하였다. 뒷다리의 MRI 스캔 3 개월 WT 및 NT 개 CXMD 5 개월. 및 AON의 후 분사 (첫 번째 주입 전에 일주) 처리 CXMD 뒷다리 자기 공명 영상 사전의 두 샘플 이미지가 표시됩니다. 2703MA 200 ㎎ / ㎏ 칵테일 morpholinos와 7 배 주간을 처리 하였다. 2001MA 120 밀리그램 / kg 칵테일 morpholinos의 배 주간 IV 주입으로 처리 하였다. 제어 및 처리 개는 나이 일치했다. 처리 된 개는 T2 신호를 감소 보여줍니다. 이미지는 ADAP 있습니다<html> 요코타 등의 등의 허가와 테드. (저작권 2009 년, 존 와일리 &amp; 선즈) (40)는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> 그림 5. 근육 개. A에 대한 생검 절차) 낮은 사지 근육 생검에 대한 고정된다. B) 포셉의 도움으로, 더 낮은 사지가 개최됩니다. 다) CT 근육이 노출된다. 오픈 생검 기술은 주사 부위의 근육 샘플들을 획득하기 위해 사용된다. 스레드 생검 샘플을 유지하는 데 사용됩니다. 절개 후 트라가 칸트 검에 D) 근육 샘플. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 세미 드라이 전송 방법. 웨스턴 블로 팅의 반 건조 전송 방법의 표현이 표시됩니다. 집중 양극 버퍼에 배어 세 논문은 음극 단자에 규정되어있다; 애노드 버퍼에 담가 3 논문이 위에 적층된다. MB의 PVDF 페이퍼 6 종이 위에 배치되기 전에 메탄올과 양극 완충액에 침지된다. 음극 버퍼에 침지 된 겔은, 상기 PVDF 종이 위에 부드럽게 뻗어있다. 마지막으로, 음극 버퍼에 담가 3 논문 겔의 상부에 배치된다. 양극 단자 상부에 설정된다. 1 시간 동안, mA이 시스템을 통해 실행된다 (400). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> 그림 7. CXMD 근육 아세포에서 엑손 스키핑. </st룽&gt; CXMD의 근육 아세포는 Ex6A, Ex6B, Ex8A, 또는 단독으로 Ex8B, 또는 네 가지의 칵테일 형질 감염시켰다. 600 ㎚의 합계는 각각의 시퀀스에 사용하고 칵테일 각 시퀀스의 600nm의 사용 하였다. A) CXMD 개 근육 아세포에서 치료를 2&#39;OMePS. Ex6A, Ex6B 및 칵테일 처리 된 샘플의 프레임 엑손 - 스킵 성적 증명서의 예상 위치에 강한 밴드를 보여줍니다. Ex8A는 중간 밴드, Ex8B이 약한 밴드를 보여줍니다 보여주고, NT는의 프레임 위치에 밴드를 표시하지 않습니다. 혼자 Ex6A에서 4 일, 형질 전환 후 B)의 cDNA 서열. 이미지가 요코타 등. 허가와 적응 (저작권 2009 존 와일리 &amp; 선즈) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> 그림 8. 증가 Dystrop2&#39;O - 메틸화 포스 (2&#39;OMePS)에 힌 식 트랜 CXMD 근육 아세포. CXMD의 근육 아세포 단독 Ex6A 또는 칵테일 2&#39;OMePS로 형질 감염시켰다. DYS-2 (빨강)과 DAPI (파란색) 염색이 표시됩니다. 처리 된 근육 아세포는 야생형 (WT) 및 비 처리 된 (NT) 아세포에 비교된다. 이미지는 요코타 등의 등의 허가를 맞게된다. (저작권 2009 존 와일리 &amp; 선즈) 40. 바 = 50 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> 근육 혼자 CXMD 개. 어느 Ex6A에서 Morpholinos의 주입 또는 Ex6A, Ex6B 및 Ex8A의 칵테일 디스트로핀 식의 그림 9. 구조는 CXMD 개의 CT 근육에 주입했다. 야생형의 디스트로핀 (DSY-1) 염색(WT), (NT) 비 처리 및 처리 CXMD 개가 표시됩니다. 개는 단독으로 1.2 mg을 Ex6A 또는 1.2 mg의 칵테일로 처리 하였다. 이미지는 요코타 등의 등의 허가를 맞게된다. (저작권 2009 존 와일리 &amp; 선즈) 40. 바 = 100 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> CXMD 개. 디스트로핀의 전신 칵테일 모르 폴리 노 처리 (DYS-1) 후 그림 10. 증가 디스트로핀 표현은 염색 (NT) (음성 대조군) 비 처리, 야생형 (WT) (양성 대조군)에 디스트로핀 식을 비교하는 데 사용되었다 및 CXMD 개는 / kg 모르 폴리 노 칵테일 (각 AON 40 ㎎ / ㎏) 120 mg을 처리 하였다. 모르 폴리 노 칵테일 Ex6A, Ex6B 및 Ex8A 포함되어 있습니다. 개는 정맥 5 회 주사 하였다 우리이 칵테일 ekly. A) 디스트로핀 (WT), NT의 두개골 경골 (CT) 근육의 표현 및 처리 강아지의 비교. B) NT 및 모르 폴리 노 칵테일 처리 개 사이의 심장 조직에서 디스트로핀 식의 비교. 로딩 제어와 같은 최근 desmin과 디스트로핀에 대한 C) 면역 블롯은 WT, NT, 및 모르 폴리 노 칵테일 처리 개에 대해 표시됩니다. 다음 근육 치료 개를위한 표시됩니다 : 삼두근 상완 (TB), 상완 이두근 (BB), 다이아 프램 (DIA), 식도 (ESO), CT는 내전근 (ADD), 신근 심지 longus (EDL), 턱 (MAS) 마음. 이미지는 요코타 등의 등의 허가를 맞게된다. (저작권 2009 존 와일리 &amp; 선즈) 40. 바 = 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> 그림CXMD 개에서 조직 병리학 개선 11. 240 ㎎ / ㎏ 모르 폴리 노 칵테일로 7 주 동안 치료. 반 년에서 5 세까지의 CXMD 개는 일단 240 ㎎ / ㎏ 모르 폴리 노 칵테일 (Ex6A, Ex6B 및 Ex8A)을 정맥 주사 하였다 칠주에 대한 주. 열네 일 마지막 주사 후, 식도 근육이 촬영하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (HE) 염색을 시행 하였다. HE 비 처리 (NT)에서 식도 근육의 염색 및 모르 폴리 노 칵테일 처리 (치료) CXMD 개 (40X 대물 렌즈). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> 임상 등급에 그림 12. 향상된 점수와 모르 폴리 노 치료. 모르 폴리 노 처리 개 후 러닝 타임 15m는 비 처리 (NT) 한배의 새끼 비교 하였다에스. 그래프에서 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. A) 임상 시험 성적 합계 스코어 치료 전후 산출하고, 처리 된 동물들은 NT 한배 새끼를 비교 하​​였다. B) 처리 및 NT 개 15m 실행 시간의 비교. B와 마찬가지로 C); 그러나, 이하의 개를 사용 하였다. 이미지가 요코타 등. 허가와 적응 (저작권 2009 존 와일리 &amp; 선즈) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 안티센스 올리고 뉴클레오티드 </td><td> 염기 서열 </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> 표 1. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 디자인.

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Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

송곳니 X-연결된 근육 영양 실조에 칵테일 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 건너 뛰기 멀티 엑손

엑손 스키핑은 현재 뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD)에 대한 가장 유망한 치료 옵션입니다. DMD 환자의 적용 가능성을 확장하고, 생성 된 절단 디스트로핀 단백질의 안정성 / 기능을 최적화하기 위해, 칵테일 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 방식을 스킵 멀티 엑손이 개발되어 우리 개 모델에서 전신 디스트로핀 구조를 입증 하였다.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

VIVO 개 근육 기능 분석에

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

연구

의학

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

세포 유전 분광법을 사용하여 특발성 척추 측만증의 예후 예측을위한 세포 기반 분석 프로토콜

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

제 2 철 염화 유도 개 경 동맥 혈전 증: 혈관 손상의 큰 동물 모델

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

모터 기능 및 듀 켄 씨 근이 영양 증 Ambulant 어린이 다른 임상 결과 매개 변수 측정

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...