Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

Exon hoppe er et lovende terapeutisk metode for behandling av DMD. Både in vitro og in vivo eksperimenter har vist at fler exon hopping er gjennomførbart. Her er anvendelsen av den CXMD hundemodellen diskutert. Først AONs ble utformet ved hjelp av Rescue-ESE og ESEfinder programmer for å målrette dystrophin eksoner 6 - 8. 2&#39;OMePS AON kjemi ble brukt for CXMD myoblast transfeksjon og morpholino AON ryggrad kjemi ble valgt for in vivo eksperimenter. vPMOs er mer effektive enn umodifiserte PMOs men på grunn av deres høyere toksisitet er de ikke egnet for systemiske injeksjoner. RNA-ekstraksjon, RT-PCR og cDNA-sekvensering ble utført på CXMD myoblaster. Hunder injisert med PMO cocktail var klinisk gradert til å vurdere noen bedring i kliniske symptomer. Etter at hundene ble humant avlivet, ble muskelprøver tatt og forberedt for kryo-seksjonering. Halveringstiden av dystrofin protein indusert av AONS er antatt å være ca 1-2 måneder. Unge voksne hunder ble brukt i denne undersøkelsen, selv om disse eksperimentene kan gjøres med neonatale hunder og eldre hunder (&gt; 5 år gamle). Preparerte muskel delene ble brukt til å evaluere histopatologi og vurdere dystrophin protein redning gjennom Western blotting og immunhistokjemi 48. Det er viktig å sikre at volumet av den PMO oppløsningen er riktig før injeksjoner; unnlater å gjøre dette vil ha vesentlig innvirkning på resultatene. Under intramuskulære injeksjoner, er tilstrekkelig trykk nødvendig å gå inn i muskelfibrene. Overvåking av hund helse og inspeksjon av kirurgi området er viktig for feilsøking. For å overvåke dyrehelse, bør ukentlige blodprøver og veiing utføres. Etter euthanization av dyret og fremstillingen av muskelprøver, et kritisk trinn for å sikre sensitivitet ved påvisning av dystrofin-proteinet er å bruke både Tris-acetat gel og halvtørr blottingmetodeni løpet av Western blotting prosedyren. Som vist i de representative resultater, myoblaster behandlet med Ex6A, Ex6B, Ex8A, og den cocktail (inneholdende Ex6A, Ex6B, Ex8A, og Ex8B) produsert i-ramme DMD-produkter. Siden Ex8B produserte ingen ekson-hoppet produkter, ble det ikke brukt i påfølgende in vivo eksperimenter. cDNA-sekvensering viste at exon 6 - 9 hopper forekom og immunocytokjemi med DYS-2-farging viste gjengitte dystrofin-ekspresjon i behandlede prøver. AON-behandlede hunder viste en signifikant økning i dystrofin-positive fibre. Dette indikerer at exon 6 - 8 var å være utelatt og en forkortet protein ble produsert. Mengden av dystrofin-positive fibere øker når en cocktail av AONs ble anvendt, og var proporsjonal med AON dosering. Immunoblotter viste økt dystrophin uttrykk i systemiske morfolino-behandlede hunder. Skjelettmuskulatur hadde varierende grad av dystrophin fiber; Men morfolino behandlet hjerte vev viste litenforbedring i dystrophin uttrykk. Siden dystrofin har en høy molekylvekt (427 kDa), kan påvisning av lave mengder av dystrofin være vanskelig. For best resultat, ble Tris-acetat gel og den halvtørre overføringsmetode som brukes. HE farging viste forbedret histopatologi i morfolino-behandlede hunder. Sentralt kjerneholdige fibre (CNFs) er et tegn på usunn muskel og representerer sykluser av muskel degenerasjon og regenerasjon. Morfolino-behandlede CXMD hunder viste en reduksjon i prosentandelen av CNFs i forhold til ikke-behandlede CXMD hunder. Klinisk gradering viste en bedring i symptomer, for eksempel økt gåing og løping evne, morfolino-behandlede dyr. Hardheten av muskler antas å reflektere muskelatrofi, og dermed ble det inkludert i sorteringsordningen 59. Hardheten av låret (hind-lem) muskler ble evaluert; imidlertid utelukket vi kranie Sartorius muskler fordi de har en tendens til å stille ut hypertrofi snarere enn svekket i CXMD. Behandlede hunder visered lavere gradering score og hadde raskere tider på 15 m løpetest. Bedre tider på 15 m test indikerer økt muskelfunksjon 40. Høyere totale gradering score indikerer dårlig helse og økt muskelatrofi. Selv om disse resultatene er lovende, fortsatt presenterer multi-exon hopper mange utfordringer som må overvinnes før teknikken har klinisk anvendelse. Cardiac vev viser fortsatt redusert opptak av AONs, sannsynligvis på grunn av forskjellen i mobilhandel mellom hjerte- og skjelettvevet. Ingen giftige effekter er observert i dyr under dagens doseringsregime; men trenger mer arbeid som må gjøres for å vurdere langsiktig giftighet før bruk av AON cocktails kan flytte til kliniske studier. Det er vanskelig å få gjennomslag for AON cocktail narkotika fordi etatene definere hver AON sekvens som en unik narkotika. Dette betyr at hver sekvens i en cocktail ville trenge å bli testet individuelt for ovy, som krever mer tid og mer penger. Et annet hinder for bruk av multi-exon hoppe i et klinisk miljø er en stor mengde mellomproteinprodukter fremstilt med ukjente funksjoner. Disse proteinene kan potensielt føre til uforutsigbare bivirkninger, avhengig av den enkelte mutasjon 22. I tillegg er mutasjonsmønstre som er tilgjengelige i dagens dystrofe hunde modeller er begrenset. Det er få naturlig forekommende mutasjoner, og ikke alle mutasjoner er nyttige for å studere fler exon hopping. Den dystrofe gris modell lover å være et godt alternativ for framtidig DMD exon hoppe studier 33, 34. DMD hunde modellene har noen fordeler fremfor andre DMD-modeller. Å være en større dyremodell, klinisk gradering og MR er mulig, noe som åpner for mer detaljerte analyser. Siden hunder er store dyr er de også mer egnet for toksikologiske studier og nærmere representere den humane sykdommen i forhold til musemodell. Dog models har også DMD gensekvenser som er mer like mennesker 23, 34, 45. Selv om teknisk utfordrende, kan multi-exon hoppe tilnærming slutt nytte&gt; 90% av DMD pasienter 24. Dette gjør det til et mye bedre alternativ til single-exon hoppe, som single-exon hoppe gjelder kun for en liten del av pasientene. I tillegg vil flere exon hoppe gjør oss i stand til å velge sletting mønstre som optimaliserer funksjonaliteten til de forkortede dystrophin proteiner. For eksempel sletting av DMD eksoner 45 - 55 er forbundet med svært milde symptomer eller asymptomatiske individer 14,19,60-63. Den multi-ekson hopper av eksoner 45 - 55 er allerede blitt påvist i en musemodell av DMD med en exon delesjon 52 (mdx52) under anvendelse av systemiske injeksjoner av vPMOs 22,26. Bruken av cocktail vPMOs har også blitt demonstrert i andre former for muskulær dystrofi, sliksom Fukuyama medfødt muskeldystrofi (FCMD). FCMD er forårsaket av exon fangst, der avvikende mRNA skjøting er forårsaket av retrotransposon innsetting. vPMOs har blitt vist å redde skjøtemønsteret i både en FCMD musemodell og i humane cellelinjer 64. Neste generasjons AON kjemi stiller høyere effekt og lavere toksisitet vil lette den faktiske oversettelsen av multi-exon hoppe tilnærming til klinisk anvendelse. I tillegg, multi-ekson hopper kan potensielt brukes på andre genetiske sykdommer, slik som dysferlinopathies 24, 65.

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en X-bundet recessiv muskel sykdom karakterisert ved progressiv muskelsvakhet, først beskrevet av Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD er en felles genetisk sykdom som påvirker om en i 3500 gutter over hele verden, med rundt 20 000 berørte barn født hvert år 2,3. Motorisk utvikling er forsinket og ganglag forstyrrelser er sett i tidlig barndom 4, etterfulgt av rullestol avhengighet på om de tidlige tenårene. Døden inntreffer vanligvis mellom 20 og 30 på grunn av respirasjonssvikt eller hjertesvikt 5-8. Det er i dag ingen kur for DMD. Behandling med glukokortikoider kan bremse utviklingen av muskel degenerasjon til en viss grad, men er forbundet med betydelige bivirkninger, inkludert fedme og diabetes mellitus 2,7,8. DMD skyldes mutasjoner i dystrophin (DMD) genet, som fører til tap av funksjonelle dystrophin Proteinkonn. DMD er en ekstremt stor gen med over 2 millioner basepar og 79 eksoner 9,10. Sletting, tull, og duplisering mutasjoner fører til out-of-frame mutasjoner er den vanligste årsaken til DMD fenotype. De områder av exoner 3 - 9 og eksoner 45 - 55 betegnes som &quot;mutasjon hotspots&quot; og de ​​fleste pasienter har delesjonsmutasjoner innenfor disse partier av genet, som fører til ikke-funksjonell dystrofin i DMD pasienter 3,9,11-16. Dystrophin funksjoner innenfor dystrophin-glykoprotein kompleks (DGC), som har en viktig rolle i muskelmembran stabilisering. N- og C-termini er de viktigste domener for funksjon, mens den sentrale stang domenet spiller en mindre viktig rolle 3,9,17. Overholdelse av en mild fenotype forbundet med Becker muskeldystrofi (BMD), som hovedsakelig skyldes i-frame mutasjoner innenfor DMD-genet, inspirert bruk av ekson hoppe for behandling av DMD. BMD pasienter har en forkortet, men funksjonellel, dystrophin protein som opprettholder både termini 3,6,18. Exon hoppe i teorien kan gjenopprette leserammen, noe som resulterer i forkortet-men-funksjonelle dystrophin proteiner lik dem man ser i BMD 3,19. Flere typer antisense oligonukleotider (AONs) har blitt testet i kliniske studier, inkludert 2&#39;o-metylert fosforotioater (2&#39;OMePS) og phosphorodiamidate morfolino oligomerer (PMOS). Hoppe exon 51 og 53 ved hjelp av disse AONs har blitt undersøkt, og mens resultatene er lovende, har enkelt-ekson hoppe begrenset anvendbarhet, da det er mutasjonsspesifikke 3, 19, 20,21, 22-26. Spørsmål også fortsatt om stabiliteten av de resulterende forkortede dystrophin proteiner produsert fra single-exon hoppe 22,23. I tillegg har noen pasienter krever mer enn en enkelt ekson som skal hoppes over, for å gjenopprette avlesningsrammen 3. Selv om det teknisk vanskeligere, er multi-exon hoppe en metode somkunne løse disse problemene 3,19. Multi-exon hoppetau har tidligere blitt demonstrert i dystrofiske hund og humane cellelinjer in vitro. I tillegg har mdx52 mus og canine X-linked muskeldystrofi (CXMD) hundemodeller blitt benyttet for in vivo-studier 22, 24-27. Canine X-bundet muskeldystrofi Japan (CXMD J) beagler ble anvendt her, da leserammen til CXMD J kan gjenopprettes ved multi-ekson hopper av eksoner 6 og 8, eller ekstra exoner (for eksempel exoner 3 - 9) (figur 1). Beagle-baserte CXMD deler den samme mutasjon mønster som Golden Retriever muskeldystrofi (GRMD) modell, men beagler er mindre og billigere å vedlikeholde på grunn av deres kroppsstørrelse, og dermed gi en nyttig modell for DMD 28,29. CXMD hunder nærmere etterligne den menneskelige DMD fenotype enn mindre dyremodeller, som gnager, og er mer pålitelig for toksikologiske vurderinger 3,22,30,31 </sopp&gt; (figur 2). CXMD hunder vise progressiv muskel forfall, gangart forstyrrelser, og hjerte-og luftveisproblemer lik dem sett i DMD. Sammenlignet med ett-ekson hopper over, er multi-ekson hoppe som gjelder for en mye større andel av pasientene. Blant de tre vanligste mutasjonstyper (slettinger, tull og duplikasjoner), 80 - kan 98% av pasientene bli behandlet gjennom multi-exon hoppe 14,32,33, mens 45% av alle DMD pasienter kan ha nytte av spesielt hoppe eksoner 45 - 55 3,19,22,34. Med utviklingen av modifiserte morpholinos, har effektiviteten av AON cocktails ved tilrettelegging exon hoppe forbedret. Arginin-rike celle-gjennomtrengende peptid-konjugert PMOs (PPMOs), og vivo-morpholinos (vPMOs) er AON kjemi som har betydelig forbedret celle-gjennomtrengende evne og stabilitet 3,35-38. Bekymringer fortsatt om langsiktig AON toksisitet; imidlertid betydelig fremganghar blitt laget. Kjemiske modifikasjoner på morpholinos sterkt redusere off-target effekter og pre-kliniske studier har rapportert ingen signifikante toksiske effekter 3,22,39,40. En resterende utfordring for multi-exon hoppe er strømmen som kreves for hver enkelt AON å bli testet for toksisitet alene, som et enkelt medikament, i stedet for sammen som en cocktail 3,19,22,41,42. I DMD studier med både single og multi-ekson Hoppe målrettet til hjertet, har det vært lite forbedring i dystrofe hjertet vev. Effekten av morpholinos i hjertet er antatt å være lav på grunn av dårlig celle-gjennomtrengende evne. Peptid-konjugert PPMOs har forbedret evne til AONs til å trenge inn i hjerteceller, å øke mengden av funksjonelt protein dystrofin reddet i hjertet 3,19,38. Her er vår AON cocktail tilnærming diskutert på lengden, inkludert utforming av AON sekvenser bruker ESEfinder programvare 43. Protocoler for hund eksperimenter med multi-exon og hopper er også beskrevet. CXMD J beagler ble brukt for eksoner 6 og 8 hoppe eksperimenter. Multi-exon hoppe i CXMD hund modellen viser lovende resultater, men utfordringer gjenstår som må overvinnes før de er klinisk relevant.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en av de mest vanlige dødelige genetiske sykdommer i verden, forårsaket av mutasjoner i DMD (DMD) genet. Exon hoppe syssels kort DNA / RNA-molekyler som kalles Antisenseoligonukleotider (AONs) som gjenoppretter leserammen og produsere kortere, men funksjonelle proteiner. Imidlertid ekson hopper behandlingen står overfor to hoved hekk: begrenset gyldighets (opp til bare 13% av pasientene kan behandles med en enkelt AON medikament) og usikker funksjon av avkortede proteiner. Disse problemene ble løst med en cocktail AON tilnærming. Mens ca 70% av DMD pasienter kan behandles ved enkelt ekson hoppe (alle eksoner kombinert), kan man potensielt behandle mer enn 90% av DMD pasienter hvis flere exon hoppe bruker cocktail antisensprimere narkotika kan realiseres. Hunden X-bundet muskeldystrofi (CXMD) hund modell, som fenotype er mer lik menneskelige DMD pasienter, ble brukt til å teste den systemiske efficACY og sikkerhet av multi-ekson hopper av eksoner 6 og 8. CXMD hundemodellen huser et spleisesete mutasjon i intron 6, som fører til en manglende exon 7 i dystrofin mRNA. Hvis du vil gjenopprette leserammen i CXMD krever multi-exon hoppe av eksoner 6 og 8; derfor CXMD er en god mellomstore dyremodell for å teste effekt og sikkerhet av multi-exon hoppe. I denne studien ble en cocktail av antisense morpholinos rettet mot ekson 6 og ekson 8 designet og den restaurert dystrophin uttrykk i kroppsdekkende skjelettmuskulatur. Metoder for transfeksjon / injeksjon av cocktail oligos og evaluering av effekt og sikkerhet av multi-exon hoppe i CXMD hund modellen blir presentert.

In vitro-forsøk Myoblasts ble transfektert med ulike 2&#39;OMePS behandlingsforhold for å sammenligne effektiviteten til hver AON. Enkelt AON behandlinger med 600 nM hver av Ex6A, Ex6B, Ex8A eller Ex8B ble gjort, samt en cocktail behandling med 600 nM hver av alle 4 AON sekvenser. RNA-prøver ble samlet fire dager etter transfeksjon. Etter RT-PCR, ble prøver for hver behandling kjørt på en gel sammen med ikke-behandlede (NT) prøver. Bånd høyere på gelen representerer ut-av-ramme DMD produkter; disse bandene ble sett i NT, Ex8A, og Ex8B behandlet myoblasts. Ex6A, Ex6B, Ex8A, og cocktail-behandlet myoblasts viste i-frame produkter. Den cocktail og Ex6A / B viste 100% i-frame produkter, mens Ex8A viste bare 30% i-frame produkter (figur 7). For å bekrefte ekson hoppe og restaurering avleserammen, cDNA-sekvensering ble utført; Resultatene indikerte at exon 6 - 9 faktisk hadde blitt hoppet over (figur 7). Immunhistokjemi viste at AON-behandlede hunder hadde økt dystrophin-positive fiber i forhold til NT prøver (Figur 8). In vivo-forsøk For å sammenligne effektiviteten av ulike AON behandlingsforhold, CXMD hunder - ble (0,5 5 år) injisert én gang med 1,2 mg Ex6A eller en cocktail av Ex6A, Ex6B, og Ex8A i ulike doser. To uker etter injeksjonen ble muskelprøver innsamlet og farget med DYS-1 for å sammenligne antall dystrophin-positive fibre. Alle cocktail-behandlede prøvene viste økt dystrophin uttrykk i forhold til NT prøver. Dystrofin-positive fibre økte med AON dosering (figur 9). Etter systemic injeksjon ble villtype (WT), NT, og cocktail-behandlede CXMD muskelprøver farget med DYS-1 (figur 10). Cocktail-behandlet CXMD hunder viste økt dystrophin uttrykk i forhold til NT CXMD hunder, både i CT og hjertemuskelprøver. Men AON behandlet muskulaturen (CT) viste mye høyere uttrykk av dystrophin forhold til behandlet hjertemuskelen. En immunoblot sammenligne WT, NT, og ulike morfolino cocktail-behandlet muskler førte til samme konklusjon. Det var også et stort utvalg av dystrophin uttrykk i de behandlede skjelettmuskelprøver (Figur 10). Hematoxylin og eosin (HE) farging viste at behandlet CXMD hunder viste forbedret histopatologi, med en signifikant reduksjon i sentral-kjerneholdige fibre (CNF) sammenlignet med NT CXMD hunder (figur 11). Dette indikerer at det er mer degenerasjon / regenerering forekommer i NT hund, et tegn på dystrofe muskelen patologi. I tillegg behandlet hundene hadde raskerekjøretider og bedre score på klinisk karakterskalaen. Behandlet CXMD hunder viste bedre score enn NT CXMD hunder i alle kategorier (figur 12). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figur 1. Mutasjon mønster av CXMD Dog og Eksoner 6 -. 8 Hoppetau Strategier Bruke et anti Cocktail CXMD hunder har en punktmutasjon i ekson 6 fører til et tap av ekson 7 i dystrofe hund mRNA. Dette resulterer i mRNA blir ut-av-ramme og dystrofin proteinproduksjon går tapt. Korte AON sekvenser som er utformet for å binde seg til ekson 6 og 8, noe som resulterer i mRNA-spleising effektivt å hoppe eksoner 6 - 8. Det grå bar om AON cocktail-behandlede hunder representerer korte AON sekvenser. Exon 9 koder for et hengsel domene og er noen ganger spontant skjøtes med AONs mot exon 6 og 8. De resulterende mRNA koder for dystrofin proteiner som er kortere, men funksjonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figur 2. Store kliniske symptomer på en ett år gammel Canine X-bundet muskeldystrofi (CXMD) Animal. A 1-åring villtype beagle og en CXMD hund vises. Involvering av proksimale, lem, og tidsmessige muskler er vanligvis observert fra 2 måneders alder. Joint kontraktur og en forskyvning av bekkenet er åpen fra 4 måneders alder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figur 3. narkose for en hund. A) Intramuscular injeksjoner og muskelbiopsi utføres under generell anestesi med isofluran. B) Gjennomføring av dyret for systemiske injeksjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figur 4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) av Wild-type, ikke-behandlede CXMD, og behandlet CXMD. MR av bakbenet på 3 måneder og 5 måneder i WT og NT CXMD hunder. To eksempler på bilder av behandlede CXMD bakben MRI pre- (en uke før første injeksjon) og etter injeksjon av AON vises. 2703MA ble behandlet 7x ukentlig med 200 mg / kg cocktail morpholinos. 2001MA ble behandlet med 5 x ukentlig IV-injeksjon av 120 mg / kg cocktail morpholinos. Kontroll og behandlet hundene var samme alder. Behandlede hunder viser redusert T2 signaler. Bildene er ADAP<html> ted med tillatelse fra Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figur 5. musicelbiopsiprosedyren for en hund. A) En lavere lem er fast for muskelbiopsi. B) Ved hjelp av tang, er den nedre lem holdt. C) Et CT-muskelen er eksponert. Åpne biopsi teknikk som benyttes for å oppnå prøver av muskel injisert områder. Tråder brukes til å holde biopsiprøver. D) Muscle prøver på tragantgummi etter disseksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6. Semi-tørr overføringsmetode. En representasjon av den halvtørre overføringsmetode for Western blotting er presentert. Tre avisene dynket i konsentrert anode buffer er lagt ned på minuspolen; 3 papirer dynket i anode buffer er stablet oppå dette. Den Mb PVDF papiret er fuktet i metanol og deretter anode-buffer før de blir lagt på toppen av de 6 papirer. Den gel, som er blitt dyppet i katode-buffer, legges forsiktig over på PVDF-papir. Endelig er 3 papirer dynket i buffer katoden lagt på toppen av gelen. Den positive terminalen er satt på toppen. For en time, 400 mA kjøres gjennom systemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figur 7. Exon Hoppetau i CXMD myoblasts. </strong&gt; CXMD myoblasts ble transfektert med Ex6A, Ex6B, Ex8A, eller Ex8B alene, eller en cocktail av alle fire. En total på 600 nM ble anvendt for de enkelte sekvenser og for cocktail 600 nM av hver sekvens ble anvendt. A) 2&#39;OMePS behandling i CXMD hunde myoblasts. Ex6A, Ex6B, og cocktail-behandlede prøvene viser sterke band på den forventede posisjonen i-frame ekson-hoppet transkripsjoner. Ex8A viser et mellomliggende band, viser Ex8B en svak band, og NT viser ikke et band på i-frame posisjon. B) cDNA sekvensering fra Ex6A alene, 4 dager etter transfeksjon. Bildene er tilpasset med tillatelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figur 8. Økt Dystrophin Expression i 2&#39;o-metylert phosphorothioate (2&#39;OMePS) Transfekterte CXMD myoblasts. CXMD myoblasts ble transfektert med Ex6A alene eller sammen med cocktail 2&#39;OMePS. DYS-2 (rød) og DAPI (blå) fargingen er vist. De behandlede myoblaster blir sammenlignet med villtype (WT) og ikke-behandlede (NT) myoblaster. Bildene er tilpasset med tillatelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figur 9. Rescue av dystrophin Expression med intramuskulære injeksjoner av Morpholinos i CXMD Dogs. Enten Ex6A alene eller en cocktail av Ex6A, Ex6B, og Ex8A ble injisert i CT musklene CXMD hunder. Dystrofin (DSY-1) farging av villtype(WT), ikke-behandlede (NT), og behandlet CXMD hunder er vist. Hundene ble enten behandlet med 1,2 mg Ex6A alene eller 1,2 mg cocktail. Bildene er tilpasset med tillatelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figur 10. Økt dystrophin Expression Etter Systemisk Cocktail Morpholino Behandling i CXMD Dogs. Dystrophin (DYS-1) farging ble brukt til å sammenligne dystrophin uttrykk i villtype (WT) (positiv kontroll), ikke-behandlede (NT) (negativ kontroll), og CXMD hunder behandlet med 120 mg / kg morfolino cocktail (40 mg / kg av hver AON). Den morfolino cocktail inneholdt Ex6A, Ex6B, og Ex8A. Hundene ble injisert intravenøst ​​5 ganger viekly med denne cocktail. A) En sammenligning av dystrophin uttrykk i kranie tibial (CT) musklene i WT, NT, og behandlede hunder. B) En sammenligning av dystrophin uttrykk i hjertet vev mellom NT og morfolino cocktail-behandlede hunder. C) Immun for dystrophin med desmin som en lasting kontroll er vist for WT, NT, og morfolino cocktail-behandlede hunder. Følgende musklene vises for behandlede hunder: triceps brachii (TB), biceps brachii (BB), diafragma (DIA), spiserør (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), tygge (MAS), og hjerte. Bildene er tilpasset med tillatelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figur11. Forbedret Histopatologi i CXMD hunder behandlet i 7 uker med 240 mg / kg Morpholino Cocktail. CXMD hunder alt fra et halvt år til fem år gammel ble injisert intravenøst ​​med 240 mg / kg morfolino cocktail (Ex6A, Ex6B, og Ex8A) en gang uke i 7 uker. Fjorten dager etter siste injeksjon, ble spiserør muskler tatt og hematoxylin og eosin (HE) farging ble gjort. HE farging av spiserøret muskler fra ikke-behandlede (NT) og morfolino cocktail-behandlet (behandlet) CXMD hunder (40X objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figur 12. Forbedret Score på Klinisk Grading og 15 m Spilletid Etter Morpholino Treatment. Morpholino-behandlede hunder ble sammenlignet med ikke-behandlede (NT) littermates. Feilfelt i grafen indikerer SEM. A) Total score på det kliniske gradering eksamenen ble beregnet før og etter behandling og behandlede dyr ble sammenlignet med NT littermates. B) En sammenligning av 15 m løpetider behandlet og NT hunder. C) På samme måte som B; imidlertid, ble unge hunder anvendt. Bildene er tilpasset med tillatelse fra Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> antisensoligonukleotid </td><td> nukleotidsekvens </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabell 1. antisensoligonukleotid Design.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-exon Hoppe Bruke Cocktail Antisenseoligonukleotider i Canine X-linked muskeldystrofi

Exon hoppe er for tiden en mest lovende behandlingsalternativ for Duchenne muskeldystrofi (DMD). For å utvide anvendelsen for DMD pasienter og for å optimalisere stabilitet / funksjon av de resulterende avkortede dystrophin proteiner, ble en multi-ekson hoppe tilnærming ved hjelp av cocktail antisensoligonukleotider utviklet og vi demonstrert systemisk dystrophin redning i en hund modell.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Cell-baserte analyseprotokollen for den prognostiske Prediksjon av idiopatisk skoliose Bruke Cellular Dielektrisk spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generasjon av Induced Pluripotent Stamceller fra muskeldystrofi Pasienter: Effektiv integrasjon fritt Omprogrammering av urin Avledet Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modellering Myotonic dystrofi 1 i C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Evaluering av ekson inkludering av skjøte bytte Antisense Oligonucleotides i SMA pasienten fibroblaster

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Ferric Chloride-indusert hjørnetann arteria carotis trombose: En stor dyr modell av vaskulære skader

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Målinger av motoriske funksjoner og andre kliniske utfallet parametere i Ambulant barn med Duchenne muskeldystrofi

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Karakteriserer Exon Skipping Effektivitet i DMD pasientprøver i kliniske studier av Antisense Oligonucleotides

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Bruke en kjemisk biopsi for graftkvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...