Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

Пропуск экзонов является перспективным терапевтическим методом для лечения МДД. В пробирке и в естественных условиях экспериментов показали , что мульти-пропуск экзонов выполнима. Здесь, использование модели собаки CXMD обсуждается. Во- первых, AONs были разработаны с использованием программ Rescue-ESE и ESEfinder целевому дистрофина экзонов 6 - 8. Химия 2&#39;OMePS AON использовали для CXMD миобластов трансфекции и морфолино AON основой химии была выбрана для проведения экспериментов в естественных условиях. vPMOs являются более эффективными, чем немодифицированные СВУП но из-за их более высокой токсичности, они не подходят для системного введения. Выделение РНК, ОТ-ПЦР, и кДНК, секвенирование проводили на миобластов CXMD. Собаки, инъецированные коктейль ОУП были клинически градуированный для оценки какого-либо улучшения клинических симптомов. После того, как собаки были гуманно усыпляют, образцы мышц были приняты и подготовлены к крио-секционирования. Полураспада белка дистрофина, индуцированное AОНы, как полагают, примерно 1 - 2 месяцев. Молодые взрослые собаки были использованы в данном исследовании, хотя эти эксперименты могут быть сделаны с неонатальной собак и собак старшего возраста (&gt; 5 лет). Подготовленные секции мышцы были использованы для оценки гистопатологии и оценки дистрофина спасения через Вестерн - блоттинга и иммуногистохимии 48. Важно обеспечить, чтобы объем раствора ОУП правильно перед инъекциями; неспособность сделать это будет иметь значительное влияние на результаты. Во время внутримышечных инъекций, достаточное давление необходимо ввести мышечные волокна. Мониторинг здоровья собаки и осмотра места операции имеют важное значение для устранения неполадок. Для мониторинга состояния здоровья животных, еженедельные анализы крови и взвешивание должно быть выполнено. После того, как euthanization животного и подготовки проб мышц, важным шагом для обеспечения чувствительности в обнаружении белка дистрофина заключается в использовании как гель Трис-ацетат и полусухим методом блоттингаво время процедуры Вестерн-блоттинга. Как показано в репрезентативных результатов, миобласты обрабатывали Ex6A, Ex6B, Ex8A и коктейль (содержащий Ex6A, Ex6B, Ex8A и Ex8B) , полученного в каркасных изделий МДД. Так как Ex8B не дали экзон-пропускаются продукты, она не была использована в последующем в экспериментах естественных условиях. кДНК последовательности показал, что экзоны 6 - 9 прыгая произошло и иммуноцитохимия с DYS-2 окрашивания показали восстановили экспрессию дистрофина в обработанных образцах. AON лечение собак показали значительное увеличение дистрофин-положительных волокон. Это указывает на то, что экзоны 6 - 8 были пропуску и укороченный белок был получен. Количество дистрофина-положительных волокон увеличивается, когда использовали коктейль из AONs и была пропорциональна дозе AON. Иммуноблоты показали повышенную экспрессию дистрофина в системных морфолино лечение собак. Скелетных мышц имели различные уровни дистрофина волокон; Тем не менее, морфолино обработанных тканей сердца показали малоулучшение экспрессии дистрофина. Так как дистрофина имеет высокую молекулярную массу (427 кДа), обнаружение малых количеств дистрофина может быть затруднено. Для достижения наилучших результатов, использовали гель Трис-ацетат и полусухой способ передачи. Его окрашивание показало улучшение гистопатологии в морфолино лечение собак. Централизованно-зародившиеся волокна (УНВ) являются признаком нездорового мышцы и представляют собой циклы дегенерация мышц и регенерации. Морфолино лечение собак CXMD показали снижение доли УНВ по сравнению с необработанными собак CXMD. Клиническая классификация показали улучшение симптомов, таких как увеличение ходьбе и беге способности, в морфолино обработанных животных. Твердость мышц , как полагают, отражает мышечную атрофию, таким образом, он был включен в схему классификации 59. Твердость бедренной кости (задних конечностей) мышц оценивали; Тем не менее, мы исключили черепных мышц Сарториус, потому что они имеют тенденцию к гипертрофии, а не атрофию в CXMD. Обработанные собаки показываютэд более низкие оценки классификации и имели более быстрое время на ходовых испытаниях на 15 м. Улучшенное время на испытания 15 м свидетельствуют о повышенной мышечной функции 40. Более высокие общие оценки классификации указывают на плохое состояние здоровья и повышенную атрофию мышц. Хотя эти результаты являются многообещающими, мульти-пропуск экзонов до сих пор представляет много проблем, которые необходимо будет преодолеть до того, как метод имеет клиническую применимость. Сердечная ткань до сих пор показывает уменьшенное поглощение AONs, вероятно, из-за разницы в клеточной торговли между сердечной и скелетной ткани. Никаких отравлений не наблюдалось у животных при текущих режимах дозировки; Тем не менее, больше работы должно быть сделано для оценки долгосрочной токсичности, прежде чем использование AON коктейлей может перейти к клиническим испытаниям. Трудно получить одобрение для AON коктейль лекарств, потому что регулирующие органы определяют каждую последовательность AON в качестве уникального лекарственного средства. Это означает, что каждая последовательность в коктейле необходимо будет индивидуально проверены на беу, требует больше времени и больше денег. Другим препятствием к использованию многоосных пропуска экзона в клинических условиях является большое количество промежуточных белковых продуктов, произведенных с неизвестными функциями. Эти белки могут потенциально привести к непредсказуемым побочным эффектам, в зависимости от индивидуальной мутации 22. Кроме того, модели мутации, имеющиеся в рамках текущих дистрофических моделей собак ограничены. Есть несколько природные мутации, и не все мутации полезны для изучения мульти-пропуск экзонов. Модель дистрофические свинья обещает быть хорошей альтернативой для будущих DMD пропуска экзонов исследования 33, 34. Модели DMD собак имеют некоторые преимущества по сравнению с другими моделями МДД. Будучи более крупная модель животных, клинические классификации и МРТ возможны, что позволяет для более детального анализа. Так как собаки крупных животных, они также больше подходят для токсикологических исследований и более точно представляют собой заболевание человека, по сравнению с мышиной модели. Собака мodels также последовательности генов DMD, которые более похожи на людей 23, 34, 45. Хотя технически сложным, перепрыгивания подход с участием многих экзон может в конечном счете выиграют&gt; 90% пациентов с МДД 24. Это делает его намного лучшей альтернативой одного пропуска экзона, так как одного пропуск экзона применим только к небольшой группе пациентов. Кроме того, мульти-пропуск экзонов позволит нам выбрать шаблоны удаления, которые оптимизируют функциональность дистрофина укороченных белков. Например, удаление DMD экзоны 45 - 55 связан с исключительно слабыми симптомами или бессимптомных лиц 14,19,60-63. Мульти-пропуск экзонов экзонов 45 - 55 уже была продемонстрирована в мышиной модели ДМД с экзон 52 удаления (mdx52) с использованием системных инъекций vPMOs 22,26. Использование коктейль vPMOs также была продемонстрирована в других формах мышечной дистрофии, такойв качестве Фукуяма врожденной мышечной дистрофии (FCMD). FCMD вызывается экзона отлова, в котором аберрантных сплайсинга мРНК вызывается введением ретротранспозона. vPMOs было показано , чтобы спасти образец сплайсинга как в качестве FCMD модели мыши и в клеточных линиях человека 64. Следующее поколение AON биохимический, проявляющие высокую эффективность и низкую токсичность будет способствовать эффективному переводу скачущей подхода с участием многих экзона в клиническом применении. Кроме того, мульти-пропуск экзонов потенциально могут быть применены к другим генетических расстройств, таких , как dysferlinopathies 24, 65.

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является Х-хромосомой рецессивное заболевание мышц характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью, впервые описанный доктором Гийом-Benjamin-Аманд Дюшенна (де Булонь) 1. DMD является распространенное генетическое заболевание , поражающее примерно 1 из 3500 мальчиков по всему миру, с примерно 20 000 пострадавших детей , рожденных каждый год 2,3. Разработка двигателя задерживается и нарушения походки проявляются в раннем детстве 4, а затем пользоваться креслом - коляской приблизительно в раннем подростковом возрасте. Смерть обычно происходит в возрасте от 20 до 30 лет из - за дыхательной или сердечной недостаточности 5-8. Там в настоящее время нет лечения для МДД. Лечение глюкокортикоидами может замедлить прогрессирование дегенерация мышц в какой - то степени , но связано со значительными побочными эффектами, включая ожирение и сахарный диабет 2,7,8. МДД является результатом мутации в дистрофина (DMD) гена, что приводит к потере функциональных дистрофина Proteiп. DMD является чрезвычайно большой ген с более чем 2 миллиона пар оснований и 79 экзонов 9,10. Делеции, нонсенс, и дублирование мутации, приводящие к вышедших из кадра мутаций являются наиболее частой причиной фенотипа МДД. Области экзонов 3 - 9 и экзонов 45 - 55, называются «мутационные горячие точки&quot; , поскольку большинство пациентов имеют делеции мутации в пределах этих участков гена, что приводит к нефункциональным дистрофина у пациентов с МДД 3,9,11-16. Дистрофина функций в рамках дистрофина-гликопротеина комплекса (DGC), который играет важную роль в стабилизации мышечной мембраны. N- и С-концы являются наиболее важными для функции домены, в то время как центральный домен стержень играет менее важную роль 3,9,17. Соблюдение мягкого фенотипа , связанного с мышечной дистрофии Беккера (БМД), которая в основном является результатом в рамке мутации в гене дистрофина, вдохновленный применение пропуска экзонов для лечения МДД. Пациенты BMD имеют укороченный, но functionaл, белок дистрофина , который поддерживает как TERMINI 3,6,18. Пропуск экзонов, в теории, может восстановить рамку считывания, в результате чего укороченных-но-функциональных белков дистрофина , подобных тем , которые наблюдаются в БМД 3,19. Несколько типов антисмысловые олигонуклеотиды (АОН) были протестированы в клинических испытаниях, в том числе 2&#39;O-метилированных фосфоротиоатов (2&#39;OMePS) и phosphorodiamidate морфолино олигомеров (PMOS). Пропуск экзонов 51 и 53 с использованием этих AONs был рассмотрен и в то время как результаты являются многообещающими, одной пропуск экзонов имеет ограниченную применимость, так как она является мутация конкретных 3, 19, 20,21, 22-26. Вопросы остаются о стабильности полученных укороченных дистрофина белков , полученных из одного пропуска экзонов 22,23. Кроме того, некоторые пациенты требуют более чем одного экзона, пропускаемых, чтобы восстановить рамку считывания 3. В то время как технически более сложным, мульти-пропуск экзонов один метод, которыймогли бы решить эти проблемы 3,19. Мульти-пропуск экзонов ранее была продемонстрирована в дистрофических собак и линий клеток человека в лабораторных условиях . Кроме того, mdx52 мыши и собачьи модели собаки Х-сцепленные мышечной дистрофии (CXMD) были использованы для Исследования in vivo 22, 24-27. Собачий Х-хромосомой мышечной дистрофии Япония (CXMD J) здесь гончие были использованы, так как рамка считывания из CXMD J может быть восстановлен с помощью нескольких пропуска экзона экзонов 6 и 8, или дополнительных экзонов (например, экзоны 3 - 9) (рис 1). Бигль на основе CXMD разделяет ту же схему мутации как модель Golden Retriever мышечная дистрофия (GRMD), но гончие имеют меньшие размеры и дешевле в обслуживании из - за их размера тела, обеспечивая тем самым полезную модель для МДД 28,29. CXMD собаки более тесно имитировать человеческий фенотип DMD , чем меньшие модели животных, как грызуна, и являются более надежными для оценки токсикологических 3,22,30,31 </sвверх&gt; (Рисунок 2). CXMD собаки дисплей прогрессивное загнивание мышц, нарушения походки, а также сердечной и дыхательной проблемы, аналогичные тем, которые наблюдаются в ДМД. По сравнению с одним пропуска экзона, мульти-пропуск экзона применим к гораздо большей части пациентов. Среди трех наиболее распространенных типов мутаций (делеции, нонсенс, и дублирующие), 80 - 98% пациентов можно лечить с помощью нескольких пропуска экзонов 14,32,33, в то время как 45% всех пациентов с МДД может извлечь выгоду из специально пропуске экзонов 45 - 55 3,19,22,34. С развитием модифицированных Morpholinos, эффективность AON коктейлей на облегчение пропуска экзона улучшилось. Аргинин богатых клеток-проникающей пептид-конъюгированного СВУП (PPMOs) и естественных условиях Morpholinos (vPMOs) являются AON биохимический , что значительно улучшилась , клеточную проникающую способность и стабильность 3,35-38. Сохраняется озабоченность в долгосрочной AON токсичности; Тем не менее, значительный прогрессбыло изготовлено. Химические изменения , внесенные в Morpholinos значительно уменьшить вне цели эффекты и доклинические исследования не сообщали о каких - либо существенных токсических эффектов 3,22,39,40. Оставшаяся задача для мульти-пропуска экзона является текущим требованием для каждого отдельного AON быть проверены на токсичность в одиночку, как один препарат, а не вместе , как коктейль 3,19,22,41,42. В исследованиях с участием как DMD с одним и несколькими пропуска экзона ориентированы на сердце, было мало улучшение дистрофии сердечной ткани. Эффективность Morpholinos в сердце, как полагают, будет низкой из-за плохой клеточной проникающей способности. Пептидные-конъюгированные PPMOs улучшили способность AONs проникнуть на кардиомиоциты, увеличивая количество функционального белка дистрофина спасенных в сердце 3,19,38. Вот, наш AON коктейль подход подробно обсуждается, в том числе при разработке AON последовательностей с использованием программного обеспечения ESEfinder 43. Protocолы для экспериментов собака с несколькими пропуска экзона также описаны. CXMD J гончие использовались для экзонов 6 и 8 пропуске экспериментов. Multi-пропуска экзонов в модели собаки CXMD показывает обнадеживающие результаты, но проблемы остаются, которые необходимо преодолеть, прежде чем они клинически применимы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является одним из наиболее распространенных смертельных генетических заболеваний во всем мире, вызванных мутациями в дистрофина (DMD) гена. Пропуск экзонов используются короткие ДНК / РНК-подобные молекулы, называемые антисмысловые олигонуклеотиды (АОН), которые восстанавливают рамку считывания и производят более короткие, но функциональные белки. Однако пропуска экзонов терапия сталкивается с двумя основными препятствиями: ограниченную применимость (только до 13% пациентов можно лечить с помощью одного препарата AON), а также неопределенную функцию укороченных белков. Эти вопросы были рассмотрены с коктейлем AON подхода. В то время как около 70% пациентов с МДД можно лечить с помощью одного пропуска экзона (экзоны все вместе взятых), можно было бы потенциально относиться к более чем 90% пациентов с МДД, если несколько пропуска экзонов с использованием антисмысловых коктейль препаратов могут быть реализованы. Собачьей Х-хромосомой мышечной дистрофии (CXMD) модель собаки, чей фенотип больше похож на пациентов с МДД человека, был использован для тестирования системного efficНКД и безопасность мульти-пропуск экзонов экзонов 6 и 8. модель собака CXMD таит в сплайс - сайт мутации в интроне 6, что приводит к отсутствию экзон 7 мРНК дистрофина. Для восстановления рамки считывания в CXMD требует нескольких пропуска экзона экзонов 6 и 8; Таким образом, CXMD хороший среднего размера модели на животных для проверки эффективности и безопасности мульти-пропуск экзонов. В текущем исследовании, коктейль из антисмысловых Morpholinos таргетингом экзона 6 и 8-й экзон был разработан и восстановлен экспрессию дистрофина в теле для всей скелетной мускулатуры. Способы трансфекции / инъекции коктейля олигомеров и оценки эффективности и безопасности многоосных пропуска экзона в модели собаки CXMD представлены.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-пропуск экзонов Использование Коктейль антисмысловые олигонуклеотиды в собачьих Х-хромосомой мышечной дистрофии

Пропуск экзонов в настоящее время является наиболее перспективным методом лечения мышечной дистрофии Дюшенна (МДД). Для того, чтобы расширить применимость для пациентов с МДД и оптимизировать стабильность / функции полученных усеченных дистрофина белков, был разработан мульти-пропуска экзонов подход с использованием коктейль антисмысловые олигонуклеотиды и мы продемонстрировали системное дистрофина спасение в модели собаки.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

В Vivo собак Пробирной функции мышц

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Клеточная Протокол анализа для прогностического Прогнозирование идиопатический сколиоз с помощью сотового диэлектрической спектроскопии

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Оценка экзона включение индуцированных сращивания переключения антисмысловых олигонуклеотидов в фибробластов SMA пациента

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Хлорида железа индуцированной собак сонной артерии тромбоза: Большой животных модель сосудистых повреждений

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Измерения в моторной функции и другие параметры клинических исходов в амбулаторная детей с мышечной дистрофии Дюшенна

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Характеристика Exon Пропуск эффективность в DMD пациент образцов в клинических испытаниях антисенс олигонуклеотидов

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Использование химической биопсии для оценки качества трансплантата

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...