Name: multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Open access fees for this article were provided by, Gene Tools, LLC.

Exon hoppa är en lovande terapeutisk teknik för behandling av DMD. Både in vitro och in vivo experiment har visat att flera exon hoppa är genomförbart. Här, är användningen av den CXMD hundmodell diskuteras. Först var AONs utformade med hjälp av Rescue-ESE och ESEfinder program för att rikta dystrofin exon 6 - 8. 2&#39;OMePS AON kemi användes för CXMD myoblast transfektion och morpholino AON ryggraden kemi valdes för in vivo experiment. vPMOs är effektivare än omodifierade PMO, men på grund av deras högre toxicitet att de inte är lämpliga för systemiska injektioner. RNA-extraktion, RT-PCR, och cDNA-sekvensering utfördes på de CXMD myoblaster. Hundar som injicerats med PMO cocktail var kliniskt graderade att bedöma någon förbättring i kliniska symptom. Efter hundarna humant avlivas, var muskelprover tas och beredas för Cryo-sektionering. Halveringstiden av dystrofin protein som induceras av AONS tros vara ca 1 - 2 månader. Unga vuxna hundar användes i denna studie, även om dessa experiment kan göras med neonatala hundar och äldre hundar (&gt; 5 år gamla). Beredda muskel sektioner användes för att utvärdera histopatologi och bedöma dystrofin protein räddning genom Western blotting och immunohistokemi 48. Det är viktigt att se till att volymen av PMO lösning är korrekt innan injektioner; underlåta att göra detta kommer att ha en betydande inverkan på resultatet. Under intramuskulära injektioner är tillräckligt tryck som krävs för att komma in i muskelfibrerna. Övervakning av hundens hälsa och kontroll av operationsstället är viktiga för felsökning. Att övervaka djurs hälsa bör vecko tester och väger blod utföras. Efter eutanasi av djuret och beredning av muskelprover, är ett kritiskt steg för att säkerställa känslighet vid detektion av dystrofin protein för att använda både Tris-acetat gel och halvtorr blotting-metodenunder Western blotting. Såsom visas i de representativa resultat, myoblaster behandlades med Ex6A, Ex6B, Ex8A, och cocktail (innehållande Ex6A, Ex6B, Ex8A och Ex8B) som produceras i-frame DMD produkter. Eftersom Ex8B gav inga exon-hoppade produkter, var det inte i efterföljande in vivo experiment. cDNA-sekvensering visade att exonerna 6-9 hoppar inträffat och immunocytokemi med DYS-2-färgning visade återställd dystrofin expression i behandlade prov. AON-behandlade hundar visade en signifikant ökning av dystrofin-positiva fibrer. Detta tyder på att exoner 6-8 var att hoppas över och en förkortad protein producerades. Mängden dystrofin-positiva fibrer ökar när en cocktail av AONs användes och var proportionell mot AON dosering. Immunoblot visade ökad dystrofin uttryck i system morfolino-behandlade hundar. Skelettmuskel hade varierande nivåer av dystrofin fibrer; emellertid, morfolino-behandlade hjärtvävnad visade liteförbättring av dystrofin uttryck. Eftersom dystrofin har en hög molekylvikt (427 kDa), kan detektion av låga mängder av dystrofin vara svårt. För bästa resultat, var Tris-acetat gel och den halvtorra överföringsmetod som används. HE-färgning visade förbättrad histopatologi i morpholino-behandlade hundar. Centralt, kärn fibrer (CNFs) är ett tecken på ohälsosam muskler och representerar cykler av muskeldegeneration och förnyelse. Morfolino-behandlade CXMD hundar visade en minskning i procentandelen av CNFs i jämförelse med icke-behandlade CXMD hundar. Klinisk gradering visade en förbättring av symtomen, såsom ökad gång och löpning förmåga, i morfolino-behandlade djur. Hårdheten av muskler tros spegla muskelatrofi och därmed var det ingår i betygssystemet 59. Hårdheten av låret (hind-lem) muskler utvärderades; däremot inte vi kraniala skräddarmuskeln eftersom de tenderar att uppvisa hypertrofi snarare än atrofi i CXMD. Behandlade hundar visared lägre betygsresultat och hade snabbare gånger på 15 m kör testet. Förbättrade gånger på 15 m testet indikerar förbättrad muskelfunktion 40. Högre totala betygs poäng indikerar dålig hälsa och ökad muskelatrofi. Även om dessa resultat är lovande, fortfarande uppvisar flera exon hoppa många utmaningar som måste övervinnas innan tekniken har klinisk tillämpbarhet. Hjärtvävnad visar fortfarande reducerad upptag av AONs, sannolikt på grund av skillnaden i cellulär handel mellan hjärt- och skelettvävnad. Inga toxiska effekter har observerats hos djur enligt gällande doseringsregimer; Men, behöver mer arbete göras för att bedöma långtidstoxicitet före användningen av AON drinkar kan flytta till kliniska prövningar. Det är svårt att få godkännande för AON cocktail droger eftersom tillsynsmyndigheter definierar varje AON sekvensen som en unik drug. Detta innebär att varje sekvens i en cocktail skulle behöva vara individuellt testat för safety, vilket kräver mer tid och mer pengar. Ett annat hinder för användningen av multi-exon hoppa i en klinisk miljö är en stor mängd av mellanliggande proteinprodukter framställda med okända funktioner. Dessa proteiner kan potentiellt leda till oförutsägbara biverkningar, beroende på den enskilda mutationen 22. Dessutom är mutationsmönster som finns inom dagens dystrofa hund modeller är begränsade. Det finns få naturligt förekommande mutationer, och inte alla mutationer är användbara för att studera multi exon skipping. Den dystrofa grismodell ser ut att bli ett bra alternativ för framtida DMD exon hoppa studier 33, 34. DMD hundmodeller har vissa fördelar jämfört med andra DMD-modeller. Att vara en större djurmodell, klinisk klassificering och MRI är möjliga, vilket möjliggör en mer detaljerad analys. Eftersom hundar är stora djur de är också mer lämpade för toxikologiska studier och närmare representerar den mänskliga sjukdomen i jämförelse med den musmodellen. hund models har också DMD gensekvenser som är mer lika människor 23, 34, 45. Även tekniskt utmanande, kunde flera exon hoppa tillvägagångssätt i slutändan gynna&gt; 90% av DMD patienter 24. Detta gör det till ett mycket bättre alternativ till en enda exon hoppa, som enda exon hoppa gäller endast för en liten del av patienterna. Dessutom kommer flera exon hoppa möjligt för oss att välja radering mönster som optimerar funktionaliteten av de förkortade dystrofin proteiner. Till exempel, radering av DMD exonema 45-55 är förknippad med exceptionellt milda symptom eller asymtomatiska individer 14,19,60-63. Multi-exon hoppa av exon 45 - 55 har redan visats i en musmodell av DMD med en exon 52 deletion (mdx52) med hjälp av systemiska injektioner av vPMOs 22,26. Användningen av cocktail vPMOs har också påvisats i andra former av muskeldystrofi, t.ex.som Fukuyama kongenital muskeldystrofi (FCMD). FCMD orsakas av exon infångning, där avvikande mRNA splitsning orsakas av retrotransposon insertion. vPMOs har visat att rädda skarvningsmönster i både en FCMD musmodell och i humana cellinjer 64. Nästa generations AON kemi uppvisar högre effekt och lägre toxicitet skulle underlätta en effektiv översättning av fler exon hoppa strategi i klinisk tillämpning. Dessutom kan multi-exon skipping potentiellt appliceras på andra genetiska störningar, såsom dysferlinopathies 24, 65.

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en X-bunden recessiv muskelsjukdom som kännetecknas av progressiv muskelsvaghet, som först beskrevs av Dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD är en vanlig genetisk sjukdom som drabbar omkring 1 i 3500 pojkar runt om i världen, med cirka 20.000 drabbade barn som föds varje år 2,3. Den motoriska utvecklingen är försenad och gångrubbningar ses i tidig barndom 4, följt av rullstolsberoende på om de tidiga tonåren. Döden inträffar oftast mellan åldrarna 20 och 30 på grund av andnings eller hjärtsvikt 5-8. Det finns idag inget botemedel för DMD. Behandling med glukokortikoider kan bromsa utvecklingen av muskeldegeneration till viss del, men är förknippad med betydande biverkningar, inklusive fetma och diabetes mellitus 2,7,8. DMD är resultatet av mutationer i dystrofin (DMD) genen, vilket leder till en förlust av funktionell dystrofin protein. DMD är en extremt stor gen med över 2 miljoner baspar och 79 exoner 9,10. Radering, nonsens, och dubbel mutationer som leder till out-of-frame mutationer är den vanligaste orsaken till DMD-fenotypen. De regioner i exonerna 3 - 9 och exoner 45 - 55 benämns &quot;mutations hotspots&quot; eftersom de flesta patienter har deletionsmutationer inom dessa delar av genen, vilket leder till icke-funktionella dystrofin i DMD-patienter 3,9,11-16. Dystrofin funktioner inom dystrofin-glykoprotein komplex (DGC), som har en viktig roll i muskelmembranstabilisering. N- och C-terminalerna är de viktigaste områdena för funktion, medan den centrala stången domänen spelar en mindre viktig roll 3,9,17. Iakttagandet av en mild fenotyp samband med Beckers muskeldystrofi (BMD), som främst härrör från i-ram mutationer i DMD-genen, inspirerade tillämpningen av exon hoppa för behandling av DMD. BMD patienter har en förkortad, men functional, dystrofin-protein som bibehåller både termini 3,6,18. Exon hoppa, i teorin, kan återställa läsramen, vilket resulterar i kortare-men-funktionella dystrofin proteiner som liknar de som ses i BMD 3,19. Flera typer av antisensoligonukleotider (AONs) har testats i kliniska prövningar, inklusive 2&#39;O-metylerade fosfortioater (2&#39;OMePS) och fosforodiamidat morfolinooligomerer (PMOS). Hoppa över exonerna 51 och 53 med hjälp av dessa AONs har undersökts och medan resultaten är lovande, har en enda exon hoppa begränsad användbarhet, eftersom det är mutationsspecifik 3, 19, 20,21, 22-26. Frågor kvarstår även om stabiliteten hos de erhållna förkortade dystrofin protein från en enda exon hoppa 22,23. Dessutom kan vissa patienter kräver mer än en enda exon som ska hoppas för att återställa läsramen 3. Även tekniskt svårare, är multi-exon hoppa en metod somkan ta itu med dessa problem 3,19. Multi-exon skipping har tidigare visats i dystrofisk hund och humana cellinjer in vitro. Dessutom har mdx52 mus och hund X-länkad muskeldystrofi (CXMD) hundmodeller använts för in vivo-studier 22, 24-27. Canine X-bunden muskeldystrofi Japan (CXMD J) beaglar användes här, eftersom läsramen för CXMD J kan återställas genom multi-exon hoppa av exoner 6 och 8, eller ytterligare exoner (t.ex. exoner 3-9) (figur 1). Beagle-baserade CXMD delar samma mutation mönster som Golden Retriever muskeldystrofi (GRMD) modell, men beaglar är mindre och billigare att underhålla på grund av sin kroppsstorlek, vilket ger en användbar modell för DMD 28,29. CXMD hundar härma närmare den humana DMD-fenotypen än mindre djurmodeller, som gnagare, och är mer tillförlitliga för toxikologiska bedömningar 3,22,30,31 </supp&gt; (Figur 2). CXMD hundar visar progressiv muskel förfall, gångrubbningar och hjärt- och andningsproblem som liknar de som ses i DMD. Jämfört med en enda exon hoppa, är multi-exon hoppa som gäller för en mycket större andel av patienterna. Bland de tre vanligaste mutationstyper (deletioner, nonsens, och dubbelarbete), 80 - kunde 98% av patienterna behandlas genom flera exon hoppa 14,32,33, medan 45% av alla DMD patienter kan dra nytta av speciellt hoppa exon 45 - 55 3,19,22,34. Med utvecklingen av modifierade morpholinos, har effektiviteten av AON cocktails underlätta exon hoppa förbättras. Arginin-rika cellpenetrerande peptid konjugerade PMO (PPMOs), och in vivo-morpholinos (vPMOs) är AON kemi som väsentligt förbättrat cellpenetrerande förmåga och stabilitet 3,35-38. Farhågor kvarstår om långtids AON toxicitet; dock betydande framsteghar gjorts. Kemiska modifieringar som gjorts morpholinos kraftigt minska off-target effekter och prekliniska studier har rapporterat några signifikanta toxiska effekter 3,22,39,40. En kvarvarande utmaning för flera exon hoppa är det nuvarande kravet för varje enskild AON som skall testas för toxicitet ensam, som ett enda läkemedel, i stället för att tillsammans som en cocktail 3,19,22,41,42. I DMD studier med både enkel- och fler exon hoppa riktade till hjärtat, har det varit liten förbättring i dystrofisk hjärtvävnad. Effekten av morpholinos i hjärtat tros vara låg på grund av dålig cellpenetrerande förmåga. Peptid konjugerade PPMOs har förbättrat förmågan hos AONs att penetrera hjärtceller, att öka mängden av funktionellt dystrofin-protein räddas i hjärtat 3,19,38. Här är vår AON cocktail metod som diskuteras utförligt, inklusive utformningen av AON-sekvenser med hjälp av ESEfinder programvara 43. Protocoler för hund-experiment med fler exon skipping beskrivs också. CXMD J beaglar användes för exonema 6 och 8 hoppa experiment. Multi-exon hoppa i CXMD hundmodell visar lovande resultat, men utmaningar kvarstår som måste övervinnas innan de är kliniskt relevant.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">2&#39;OMePS Transfection of Dog Myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml 6 welled plates</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5816-006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Penicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>&#160;200 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18292-011</td>
			<td>Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.&#160; 
			10 mL lipofectin for 5 mg RNA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;OMePS</td>
			<td>Eurogentec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-114</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333&#160;</td>
			<td>200 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Morpholino transfection of dog myoblasts&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts&#160; for culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>
			Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>1mL/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td>200 uL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td colspan="2">Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer in exon 5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 mL 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer in exon 10&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			1.5 L 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPS</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-cycler</td>
			<td>Scinco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Complementary DNA (cDNA) Sequencing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifudge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4337454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&#160;Intramuscular injections or open muscle biopsy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Scissors, Scapal, needle, surgical thread&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Ointment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophors&#160;</td>
			<td>webtextiles</td>
			<td>12190-71-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorohexidine</td>
			<td>Peridex</td>
			<td>12134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drapes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srubs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facial Mask&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gloves&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Covering&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense morpholinos&#160;</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td></td>
			<td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC 
			TCAGG), 
			Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG 
			AGCGTT),&#160; 
			Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT 
			GCTCAC)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			120&#8211;200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine hydrochloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tougne Depressor&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalexin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefazolin</td>
			<td></td>
			<td>15 to 30 mg/kg&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>buprenorphine&#160;</td>
			<td></td>
			<td>0.01 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">&#160;buprenorphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>0.02 mg/kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systemic Injections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe infusion pump&#160;</td>
			<td>Muromachi&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Indwelling needles</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG3-2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needles&#160;</td>
			<td>TERUMO&#160;</td>
			<td>SG3-2325&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe&#160;</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SG2-03L2225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td>
			<td>28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Grading of Dogs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic resonance imaging (MRI)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Tesla MRI l&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm diameter/18 cm length human extremity coi</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Muscle sampling and preparation (necropsy)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental sodium&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Tanabe Pharma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>20 mg/kg&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott laboratories&#160;</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>2-3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth gum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqoud Nitrogrn&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork Discs</td>
			<td>Iwai-kagaku&#160;</td>
			<td>101412-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine&#8211;coated slides&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-037-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Microsystem&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>cm1900&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS2</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS2&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21125</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat antimouse IgG2&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>1:2,500 dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Contans mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10000C</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisture chamber&#160;</td>
			<td>Scientific Devise Laboratory&#160;</td>
			<td>197-BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slide&#160;</td>
			<td>Lab-tek&#160;</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flpurescent microcope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>594 nm at 20X magnification.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distillied Water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Homogenizer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Laemmli SDS-loading buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M Tris&#8211;HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-1210</td>
			<td>5% resolving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS gels</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen, WG1601BOX</td>
			<td>3-8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer (1&#215;)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10% 10&#215; buffer, 20% methanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% PBS/Tween 20 (PBST)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 mL&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			3&#215; 200 mL for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST/5% milk powder&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>BCA</td>
			<td>T9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td>NuPage Invitrogen</td>
			<td>NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentred Anode Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20 % Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desmin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYS1&#160;</td>
			<td>Novocastra&#160;</td>
			<td>NCL-DYS1&#160;</td>
			<td>1:150 dilutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-exon skipping using cocktail antisense oligonucleotides in the canine x-linked muscular dystrophy

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en av de vanligaste letala genetiska sjukdomar över hela världen, orsakas av mutationer i dystrofin (DMD) -genen. Exon hoppa använder kort DNA / RNA-molekyler kallade antisensoligonukleotider (AONs) som åter läsramen och producera kortare men funktionella proteiner. Men ansikten exon hoppa terapi två stora hinder: begränsad tillämplighet (upp till endast 13% av patienterna kan behandlas med en enda AON läkemedel), och osäker funktion av stympade proteiner. Dessa frågor togs upp med en cocktail AON strategi. Medan cirka 70% av DMD patienter kan behandlas genom en enda exon hoppa (alla exoner i kombination), kan man eventuellt behandla mer än 90% av DMD patienter om flera exon hoppa med hjälp av cocktail antisens-läkemedel kan realiseras. Hundens X-bunden muskeldystrofi (CXMD) hundmodell, vars fenotyp är mer lik humana DMD patienter användes för att testa system efficACY och säkerhet av multi-exon hoppa av exoner 6 och 8. CXMD hundmodell hamnar en splitsningsställe mutation i intron 6, vilket leder till en brist av exon 7 i dystrofin mRNA. För att återställa läsramen i CXMD kräver flera exon hoppa av exon 6 och 8; Därför är CXMD en bra medelstort djurmodell för att testa effekten och säkerheten av multi-exon hoppa. I den aktuella studien var en cocktail av antisens morpholinos inriktade exon 6 och exon 8 utformade och det restaurerade dystrofin uttryck i kroppsomfattande skelettmuskulaturen. Metoder för transfektion / injektion av cocktail oligos och utvärdering av effekten och säkerheten av multi-exon hoppa i CXMD hundmodell presenteras.

Experiment in vitro Myoblaster transfekterades med olika 2&#39;OMePS behandlingsförhållanden för att jämföra effektiviteten hos varje AON. Enkel AON behandlingar med 600 nM vardera av Ex6A, Ex6B, Ex8A eller Ex8B utfördes, såväl som en cocktail behandling med 600 nM vardera av alla 4 AON sekvenser. RNA-prover samlades upp fyra dagar efter transfektion. Efter RT-PCR, prover för varje behandling kördes på en gel tillsammans med icke-behandlade (NT) prover. Band högre på gelén representerar out-of-frame DMD produkter; dessa band sågs i NT, Ex8A och Ex8B behandlade myoblaster. Ex6A, Ex6B, Ex8A och cocktailbehandlade myoblaster visade i-frame produkter. Cocktail och Ex6A / B visade 100% i-ram produkter, medan Ex8A visade endast 30% i-frame produkter (Figur 7). För att bekräfta exon hoppa och restaurering avläsramen, var cDNA-sekvensering utfördes; resultaten visade att exonerna 6-9 verkligen hade hoppat (Figur 7). Immunohistokemi visade att AON-behandlade hundar hade ökat dystrofin-positiva fibrer jämfört med NT prover (Figur 8). Experiment in vivo Att jämföra effektiviteten hos olika AON behandlingsförhållanden, CXMD hundar - var (0,5 5 år gamla) injiceras en gång med 1,2 mg Ex6A eller en cocktail av Ex6A, Ex6B och Ex8A vid olika doseringar. Två veckor efter injektionen togs muskelprover uppsamlades och färgades med DYS-1 för att jämföra antalet dystrofin-positiva fibrer. Alla cocktail-behandlade prov visade ökad dystrofin uttryck jämfört med NT prover. Dystrofin-positiva fibrer ökade med AON dosering (Figur 9). efter systemetic injektion, var vildtyp (WT), NT, och cocktail behandlade CXMD muskelprover färgades med DYS-1 (figur 10). Cocktail-behandlade CXMD hundar visade ökad dystrofin uttryck jämfört med NT CXMD hundar, både i CT och hjärtmuskelprover. Men AON behandlad skelettmuskulatur (CT) visade mycket högre uttryck av dystrofin jämfört med behandlad hjärtmuskeln. En immunoblot som jämför WT, NT, och olika morfolino cocktail-behandlade muskler ledde till samma slutsats. Det fanns också ett stort utbud av dystrofin uttryck i de behandlade skelettmuskelprover (Figur 10). Hematoxylin och eosin (HE) färgning visade att behandlad CXMD hundar visade förbättrad histopatologi, med en betydande minskning av centralt kärn fibrer (CNF) i jämförelse med NT CXMD hundar (Figur 11). Detta indikerar att det finns mer degeneration / regeneration förekommer i NT hund, ett tecken på dystrofisk muskler patologi. Dessutom behandlade hundar hade snabbarekör gånger och förbättrade poäng på den kliniska betygsskalan. Behandlade CXMD hundar visade bättre resultat än NT CXMD hundar i alla kategorier (Figur 12). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figur 1. Mutation Mönster av CXMD hund och Exonerna 6 -. 8 Hoppa över strategierna genom en antisens Cocktail CXMD hundar har en punktmutation i exon 6 leder till en förlust av exon 7 i dystrofisk hund mRNA. Detta resulterar i mRNA som är ut-av-ram och dystrofin proteinproduktion är förlorad. Korta AON sekvenser är utformade för att binda till exon 6 och 8, vilket resulterar i mRNA-splitsning effektivt hoppa exonema 6 - 8. Den grå stapeln i AON cocktail-behandlade hundar representerar korta AON sekvenser. Exon 9 kodar en gångjärnsdomän och är ibland spontant splitsas ut med AONs mot exon 6 och 8. De resulterande mRNA kodar för dystrofin proteiner som är kortare men funktionenal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figur 2. Stora kliniska symptom på en 1-årig Canine X-bunden muskeldystrofi (CXMD) Animal. A 1-årig vildtyp beagle och en CXMD hund visas. Medverkan av proximala, lem, och tids muskler typiskt observeras från 2 månaders ålder. Gemensamt kontraktur och en förskjutning av bäckenet är öppen från 4 månaders ålder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figur 3. narkos en hund. A) Intramuscular injektioner och muskelbiopsier utförs under narkos med isofluran. B) Innehav av djur för system injektioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figur 4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) av vildtyp, icke-behandlade CXMD och behandlades CXMD. MRT av bakbenet vid 3 månader och 5 månader i WT och NT CXMD hundar. Två exempelbilder av behandlade CXMD bakbenen MRI för- (1 vecka före den första injektionen) och efter injektion av AON visas. 2703MA behandlades 7x varje vecka med 200 mg / kg cocktail morpholinos. 2001MA behandlades med 5x vecka intravenös injektion av 120 mg / kg cocktail morpholinos. Kontroll och behandlade hundar var åldersmatchade. Behandlade hundar visar minskad T2 signaler. Bilder är ADAP<html> Ted med tillstånd från Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figur 5. muskelbiopsi ordningen för en hund. A) En nedre extremiteterna fastställs för muskelbiopsi. B) Med hjälp av pincett, är den nedre extremiteten hållas. C) CT muskeln utsätts. Öppen biopsi teknik används för att erhålla muskelprover av injicerade platser. Trådar används för att hålla biopsiprov. D) Muscle prov på dragantgummi efter dissekering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6. Halvtorr överföringsmetod. En representation av den halvtorra överföringsmetod för Western blotting presenteras. Tre papper indränkt i koncentrerad anod buffert fastställs vid minuspolen; 3 papper indränkt i anod buffert staplas ovanpå detta. Den Mb PVDF papper är indränkt i metanol och därefter anod buffert innan de lägges ovanpå de 6 papper. Gelén, som har dränkts in med katodbuffert, lägges försiktigt över den PVDF-papper. Slutligen 3 papper indränkt i katodbufferten läggs ovanpå gelén. Den positiva terminalen är inställd på toppen. För en timme, 400 mA drivs genom systemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figur 7. Exon Hoppa i CXMD myoblaster. </stRong&gt; CXMD myoblaster transfekterades med Ex6A, Ex6B, Ex8A eller Ex8B ensam, eller en cocktail av alla fyra. Totalt 600 nM användes för de individuella sekvenser och för cocktail 600 nM av varje sekvens användes. A) 2&#39;OMePS behandling i CXMD hund myoblaster. Ex6A, Ex6B och cocktail-behandlade proven visar starka band vid den förväntade positionen i ram exon-hoppade transkript. Ex8A visar ett mellanliggande band, visar Ex8B ett svagt band, och NT visar inte ett band vid den i-ramens position. B) -cDNA sekvense från Ex6A ensam, 4 dagar efter transfektion. Bilderna anpassas med tillstånd från Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figur 8. Ökad Dystrophin Expression i 2&#39;O-metylerade fosforotioat (2&#39;OMePS) transfekterade CXMD myoblaster. CXMD myoblaster transfekterades med Ex6A ensam eller med cocktail 2&#39;OMePS. DYS-2 (röd) och DAPI (blå) färgning visas. De behandlade myoblaster jämförs med vildtyp (WT) och icke-behandlade (NT) myoblaster. Bilderna anpassas med tillstånd från Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Klicka god här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figur 9. Räddning av dystrofin Expression med intramuskulära injektioner av Morpholinos i CXMD Dogs. Antingen Ex6A enbart eller en cocktail av Ex6A, Ex6B och Ex8A injicerades i CT-musklerna i CXMD hundar. Dystrofin (DSY-1) färgning av vildtyp(WT), icke-behandlade (NT), och behandlade CXMD hundar visas. Hundar behandlades antingen med 1,2 mg Ex6A enbart eller 1,2 mg cocktail. Bilderna anpassas med tillstånd från Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Klicka god här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figur 10. Ökad dystrofin Expression Efter Systemisk Cocktail Morfolino Behandling i CXMD Dogs. Dystrofin (Dys-1) färgning användes för att jämföra dystrofin expression i vild typ (WT) (positiv kontroll), icke-behandlade (NT) (negativ kontroll), och CXMD hundar som behandlats med 120 mg / kg morfolino cocktail (40 mg / kg av varje AON). Morpholino cocktail innehöll Ex6A, Ex6B och Ex8A. Hundar injicerades intravenöst 5 gånger viekly med denna cocktail. A) En jämförelse av dystrofin uttryck i hjärn tibial (CT) musklerna i WT, NT, och behandlade hundar. B) En jämförelse av dystrofin uttryck i hjärtvävnaden mellan NT och morfolino cocktail-behandlade hundar. C) Immun för dystrofin med desmin som en laddningskontroll visas för WT, NT, och morfolino cocktail-behandlade hundar. Följande muskler visas för behandlade hundar: triceps brachii (TB), biceps brachii (BB), membran (DIA), matstrupe (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), tugg (MAS), och hjärta. Bilderna anpassas med tillstånd från Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Klicka god här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figur11. Förbättrad Histopatologi i CXMD hundar som behandlats i 7 veckor med 240 mg / kg morfolino Cocktail. CXMD hundar som sträcker sig från ett halvår till fem år gamla injicerades intravenöst med 240 mg / kg morfolino cocktail (Ex6A, Ex6B och Ex8A) en gång vecka i 7 veckor. Fjorton dagar efter den sista injektionen, var matstrupe muskler tas och hematoxylin och eosin (HE) färgning gjordes. HE färgning av matstrupe muskler från icke-behandlade (NT) och morfolino cocktail behandlade (Behandlade) CXMD hundar (40X objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figur 12. Förbättrade Poäng på klinisk klassificering och 15 m Längd Efter morfolino behandling. Morfolino-behandlade hundar jämfördes med icke-behandlade (NT) kulls. Felstaplar i grafen visar SEM. A) Total poäng på kliniska betygsprov beräknades före och efter behandlingen och behandlade djur jämfördes med NT syskon. B) En jämförelse av 15 m körtider av behandlade och NT hundar. C) I likhet med B; emellertid var yngre hundar användes. Bilderna anpassas med tillstånd från Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antisens-oligonukleotid </td><td> nukleotidsekvens </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabell 1. antisensoligonukleotid design.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy at JoVE.com

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Multi-exon Hoppa Använda Cocktail antisensoligonukleotider i Canine X-bunden muskeldystrofi

Exon hoppa är för närvarande mest lovande behandlingsalternativ för Duchennes muskeldystrofi (DMD). Att utvidga tillämpningen för DMD-patienter och för att optimera stabiliteten / funktion av de resulterande trunkerade dystrofin proteiner, var en multi-exon hoppa tillvägagångssätt och använda cocktail antisensoligonukleotider utvecklats och vi visade system dystrofin räddning i en hundmodell.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine muskelfunktion analys

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Cell-baserade analysprotokoll för Prognostic Prediktion av idiopatisk Skolios Använda Cellular Dielektrisk spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från muskeldystrofi Patienter: Effektiv integration fria Omprogrammering av urin härledda celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Modellering myotonika Dystrophy 1 i C2C12 myoblastceller

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

Utvärdering av Exon integration induceras av skarva växlingen Antisense oligonukleotider i SMA patienten fibroblaster

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury

Järnklorid-inducerad Hundarnas halspulsådern trombos: En stor djurmodell av vaskulär skada

Occlusive arterial thrombosis leading to cerebral ischemic stroke and myocardial infarction contributes to ~13 million deaths every year globally. Here, ...

Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy

Mätningar av motorisk funktion och andra kliniskt resultat parametrar hos ambulanta barn med Duchennes muskeldystrofi

While the number of new treatment options tested in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) is increasing, there is still no defining of the most ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Karaktärisera Exon Hoppa effektivitet i DMD patientprover i kliniska prövningar av Antisense Oligonukleotider

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...