Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة أوتاوا (أخلاقيات الحيوان بروتوكول أوهري-1696). وقد أجريت رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. 1. عزل خلايا الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية <ol style=";text-align:right;direction:r...

تقدم العزلة وثقافة الأساسي L-اللجان الدائمة فرصة لفهم أفضل وظيفة وتفاعلها مع السكان خلية أخرى على المستوى الخلوي، ودورها في التنمية الرئة، والصحة والمرض. وهذا أمر مهم خاصة أن عدم وجود علامة واحدة معينة من هذه الخلايا تجعل من شبه المستحيل لدراسة هذه الخلايا في المو?...

يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. خلال التنمية، بما في ذلك الرئة، واللحمة المتوسطة تعد مصدرا مهما من العظة التنموية، واللجان الدائمة المقيمين هي المرشح المرجح أن يكون في مركز هذا. وعلاوة على ذلك، تظهر دلائل على ومضطرب أن اللجان الدائمة المقيمين في أمراض البالغين، بما في ذلك السرطان وتليف 1،2 3. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا 4. الخلايا الجذعية مستضد 1 تم تحديد (SCA-1) في الفئران كعلامة لمجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية الأنسجة، ويمكن استخدامها لعزل L-اللجان الدائمة 5، ولكن للاسفلا يعرف orthologs في الأنواع الأخرى 6. وأفاد الباحثون مجموعة متنوعة من أساليب العزلة مختلفة لعزل L-اللجان الدائمة سواء من أنسجة الرئة أو السوائل. هذه تختلف من مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) على أساس أساليب اختيار لCD31 - / CD45 - / CD90 + الخلايا 7، CD31 - / CD45 - / الظهارية خلية التصاق جزيء (EpCAM) - / هيئة السلع التموينية-1 + خلايا 8، المقاومة للأدوية المتعددة نقل ATP كاسيت ملزمة G (ABCG2) خلايا إيجابية 9 أو هويشت 33342 صبغ هروب رأس المال 10، إلى التقيد البلاستيك 11،12 والهجرة من مفروم النسيج 13. مزايا الطريقة هنا المعروضة لعدة أضعاف. باستخدام الهضم الأنزيمي لطيف والتدرج الكثافة 14، واحد يحصل على جميع خلايا نطاق الكثافة التي تشمل اللجان الدائمة ولكنها تستبعد الخلايا الظهارية أو البطانية. الخطوة التزام البلاستيكية اللاحقة يضمن فقط mesenchخلايا ymal التمسك والبقاء في الثقافة، والقضاء على الكريات البيض. الأهم من ذلك، في خطوة اختيار CD146 + يسمح للقضاء على الخلايا الليفية، وهذه الخلايا لا تعبر عن CD146. يرتبط ارتباطا وتعبيرا عن التصاق الخلية الجزيء CD146 بإيجابية مع multipotency، وبالتالي فهي علامة جيدة للتخلص من الخلايا الليفية من سكان الخلية الوسيطة 15-19. هذا هو ميزة على استخدام CD90 كعلامة الاختيار، كما لا يعبر عنه إلا في اللجان الدائمة ولكن أيضا في lipofibroblasts 5،20. في هذا البروتوكول الذي اخترناه صراحة مجموعة مختارة حبة المغناطيسي، كما هو ألطف على الخلايا، والإجراء بأكمله يمكن أن يتم في ظروف معقمة. ميزة هامة أخرى من هذا الأسلوب العزلة بدلا من طريقة ثمرة، هو أنه سريع نسبيا، 6-10 أيام بدلا من شهر واحد أو أكثر للأسلوب ثمرة. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من العزلة الأولية السكان الوسيطة جاهز للCD146 + سيلي<html> ction. بعد 3-5 أيام آخر الخلايا CD146 + جاهزة لاستخدامها في التجارب أو يمكن تجميدها لاستخدامها لاحقا. الوقت انخفضت الثقافة يحسن نوعية الخلايا كما تحورها اللجان الدائمة نحو الخلايا الليفية لفترات طويلة خارج الحي الثقافة 19. وأخيرا، ونظرا للطبيعة البروتوكول، فمن الممكن تطبيق هذه الطريقة مع الأنواع الأخرى ببساطة عن طريق اختيار الأجسام المضادة المناسبة، أو حتى إلى أجهزة الجسم الأخرى عن طريق ضبط خيارات إنزيمات الهضم وفترة حضانة. يعطى بروتوكول مفصل لهذا الأسلوب العزلة أدناه، وتقدم عرضا عاما من العزلة واختيار لاحقة من حيوانية CD146 + في الشكل 1A 1B وعلى التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تضمنت تفاصيل عن الركض، وتجميد والذوبان هذه الخلايا. إعلان / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لعزل الخلايا الرئوية الوسيطة (A) وCD146 لاحق + اختيار الخلية (ب) دقيقة = دقيقة؛ EDTA = ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل. 2 الثانية أب = الأجسام المضادة الثانوية؛ ألفا CD146 أب = الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة CD146. خلايا، لقد = CD146 الخلايا السلبية. + لقد خلايا إيجابية الخلايا = CD146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. وعلاوة على ذلك، فإنها من المحتمل أن يكون لها دور في تطوير الجهاز العادي، ونسبت الأدوار في المرض، وخاصة تلك التي لها طبيعة متليفة. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا. تقنية العزل الموصوفة هنا تنطبق خصائص متعددة من اللجان الدائمة المقيمين الرئة (L-اللجان الدائمة). على التضحية من الفئران، تتم إزالة الرئتين وتشطف عدة مرات لإزالة الدم. وبعد تفكك الميكانيكي بواسطة مشرط، يتم هضمها الرئتين لمدة 2-3 ساعة باستخدام مزيج من نوع كولاجيناز الأول، البروتيني محايد ونوع الدناز أولا obtaineيتم غسل د تعليق خلية واحدة في وقت لاحق، ومركبة على كثافة متوسطة الانحدار (الكثافة 1.073 غ / مل). بعد الطرد المركزي، ويتم غسل الخلايا من الطور البيني ومطلي في قوارير المعالجة الثقافة. الخلايا المستنبتة ل4-7 أيام في الفسيولوجي 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 الشروط. في استنزاف الخلايا الليفية (CD146 -) وضمان عدد سكانها فقط L-اللجان الدائمة (CD146 +)، واختيار إيجابية للCD146 + الخلايا تتم من خلال اختيار حبة المغناطيسي. باختصار، هذا الإجراء ينتج موثوق يبلغ عدد سكانها الأساسي L-اللجان الدائمة لمزيد من الدراسة والتلاعب في المختبر. ونظرا للطبيعة البروتوكول، فإنه يمكن بسهولة أن تترجم إلى النماذج الحيوانية التجريبية الأخرى.

اثنين من الخصائص الفيزيائية الأكثر موثوقية من اللجان الدائمة والكثافة والالتزام البلاستيك، وتستخدم في الجزء الأول من هذا البروتوكول إلى الحصول على جزء الخلية الوسيطة في الرئة يحتوي على L-اللجان الدائمة. على الرغم من أن البيني كثافة التدرج ستشمل حي...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

يصف هذا البروتوكول تقنية العزل للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الأولية من الفئران، من خلال استخدام الهضم الأنزيمي، كثافة الفصل المتدرج، والتقيد البلاستيك وCD146 + اختيار حبة المغناطيسي.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...