Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00
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JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

सभी प्रक्रियाओं ओटावा विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति (पशु आचार प्रोटोकॉल ओहरी-1696) द्वारा अनुमोदित किया गया। जानवरों की देखभाल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था। <p class="jov...

अलगाव और प्राथमिक एल MSCS की संस्कृति को बेहतर अपने समारोह और एक सेलुलर स्तर पर अन्य सेल आबादी के साथ उनकी बातचीत, और फेफड़ों के विकास, स्वास्थ्य और रोग में उनकी भूमिका को समझने का अवसर प्रस्तुत करता है। य?...

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) तेजी से रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए पहचाने जाते हैं, फेफड़ों के रोगों सहित। अस्थि मज्जा और exogenous सेल थेरेपी के लिए गर्भनाल MSCs के उपयोग के अलावा, वहाँ भी निवासी ऊतक MSCs की मरम्मत में ब्याज और पुनर्योजी क्षमता बढ़ रही है। विकास के दौरान, फेफड़ों में शामिल है, mesenchyme विकासात्मक संकेतों का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, और MSCs निवासी एक संभावित उम्मीदवार इस के केंद्र में होना करने के लिए कर रहे हैं। इसके अलावा, सबूत में उभर रहा है कि निवासी MSCs वयस्क रोगों में आनाकानी कर रहे हैं कैंसर 1,2 और 3 फाइब्रोसिस भी शामिल है। इन ऊतक निवासी MSCs के अध्ययन के लिए मुख्य बाधा अलगाव और इन कोशिकाओं 4 की पहचान के लिए एक स्पष्ट मार्कर की कमी है। स्टेम सेल प्रतिजन -1 (एससीए -1) ऊतक स्टेम कोशिकाओं की एक किस्म के लिए एक मार्कर के रूप में चूहों में पहचान की थी, और एल MSCs 5 के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन दुर्भाग्य हैकोई अन्य प्रजातियों 6 में जाना जाता orthologs। शोधकर्ताओं ने या तो फेफड़े के ऊतकों या तरल पदार्थ से एल MSCs के अलगाव के लिए अलग अलग तरीकों की एक किस्म की सूचना है। / CD45 - - / CD90 + कोशिकाओं 7, CD31 - / CD45 - / उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) - ये छँटाई (FACS) आधारित विधियों CD31 के लिए चयन प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल से बदलती हैं / SCA-1 + कोशिकाओं 8, बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर एटीपी बाध्यकारी कैसेट जी (ABCG2) सकारात्मक कोशिकाओं 9 या Hoechst 33342 डाई तपका 10, प्लास्टिक पालन 11,12 और कीमा बनाया हुआ ऊतक 13 से बाहर पलायन करने के लिए। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि के लाभ में कई गुना कर रहे हैं। एक सज्जन enzymatic पाचन और घनत्व ढाल 14 का उपयोग करके, एक घनत्व रेंज के सभी कोशिकाओं है कि MSCs शामिल हैं, लेकिन उपकला या endothelial कोशिकाओं को बाहर प्राप्त करता है। बाद में प्लास्टिक पालन कदम है कि केवल mesench सुनिश्चित करता हैymal कोशिकाओं पालन करना और संस्कृति में रहना है, ल्यूकोसाइट्स को नष्ट करने। सबसे महत्वपूर्ण बात यह हालांकि, CD146 + चयन कदम इन कोशिकाओं CD146 व्यक्त नहीं करते, fibroblasts के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है। कोशिका आसंजन अणु CD146 की अभिव्यक्ति सकारात्मक multipotency के साथ जोड़ा जाता है, और इसलिए एक mesenchymal सेल की आबादी 15-19 से fibroblasts को साफ़ करने के लिए एक अच्छा मार्कर है। के रूप में यह केवल MSCs में बल्कि lipofibroblasts 5,20 में व्यक्त नहीं कर रहा है यह, CD90 एक चयन मार्कर के रूप में प्रयोग पर एक फायदा है। इस प्रोटोकॉल में हम स्पष्ट रूप से, एक चुंबकीय मनका चयन को चुना है के रूप में यह कोशिकाओं पर gentler है, और पूरी प्रक्रिया बाँझ परिस्थितियों में किया जा सकता है। इस अलगाव विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ के रूप में परिणाम विधि करने का विरोध किया है, कि यह अपेक्षाकृत तेजी, 6-10 दिनों के रूप में परिणाम है विधि के लिए एक महीने या अधिक करने का विरोध किया है। तीन से पांच दिनों के प्रारंभिक अलगाव के बाद mesenchymal आबादी CD146 + Sele के लिए तैयार है<html> ction; एक और तीन से पांच दिनों के बाद CD146 + कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं या बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है। के रूप में लंबे समय तक MSCs पूर्व vivo संस्कृति 19 में fibroblasts की ओर transdifferentiate संस्कृति के कम समय कोशिकाओं की गुणवत्ता में सुधार। अन्त में, प्रोटोकॉल की प्रकृति के कारण, यह संभव है बस पाचन एंजाइमों और ऊष्मायन समय की पसंद का समायोजन करके भी करने के लिए उचित एंटीबॉडी का चयन, या अन्य अंग प्रणालियों द्वारा अन्य प्रजातियों के लिए इस पद्धति लागू करने के लिए है। इस अलगाव विधि की एक विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे दी गई है, और अलगाव और CD146 + उप-जनसंख्या के बाद के चयन की एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन क्रमशः चित्रा 1 ए और 1 बी में प्रदान की जाती है। इसके अतिरिक्त, विवरण, passaging के लिए शामिल किए गए हैं ठंड और इन कोशिकाओं विगलन। विज्ञापन / 53,782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; । चित्रा 1. फेफड़े mesenchymal कोशिकाओं (ए) और बाद में CD146 + सेल के चयन (बी) = मिनट मिनट के अलगाव के योजनाबद्ध अवलोकन; EDTA = ethylenediaminetetraacetic एसिड; 2 एन डी AB = माध्यमिक एंटीबॉडी; α-CD146 AB = प्राथमिक विरोधी CD146 एंटीबॉडी; -ve कोशिकाओं = CD146 नकारात्मक कोशिकाओं; + कोशिकाओं = CD146 सकारात्मक कोशिकाओं किया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) तेजी से रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए पहचाने जाते हैं, फेफड़ों के रोगों सहित। अस्थि मज्जा और exogenous सेल थेरेपी के लिए गर्भनाल MSCs के उपयोग के अलावा, वहाँ भी निवासी ऊतक MSCs की मरम्मत में ब्याज और पुनर्योजी क्षमता बढ़ रही है। इसके अलावा, वे संभावना सामान्य अंग विकास में एक भूमिका है, और जिम्मेदार ठहराया गया है रोग में भूमिका, विशेष रूप से एक तंतुमय प्रकृति के साथ थे। इन ऊतक निवासी MSCs के अध्ययन के लिए मुख्य बाधा अलगाव और इन कोशिकाओं की पहचान के लिए एक स्पष्ट मार्कर की कमी है। अलगाव तकनीक यहाँ वर्णित फेफड़ों निवासी MSCs (एल MSCs) के कई विशेषताओं लागू होता है। चूहों के बलिदान पर, फेफड़ों हटा दिया है और रक्त को दूर करने के लिए कई बार rinsed हैं। छुरी से यांत्रिक हदबंदी के बाद, फेफड़ों collagenase प्रकार मैं तटस्थ प्रोटीज और DNase प्रकार मैं obtaine का एक मिश्रण का उपयोग कर 2-3 घंटे के लिए पचा रहे हैंडी एकल कक्ष निलंबन बाद में धोया और घनत्व ढाल मध्यम (घनत्व १.०७३ जी / एमएल) पर स्तरित है। centrifugation के बाद, अंतरावस्था से कोशिकाओं को धोया और संस्कृति का इलाज बोतल में चढ़ाया जाता है। प्रकोष्ठों शारीरिक 5% 2 हे में 4-7 दिनों 5% सीओ 2 की स्थिति के लिए सुसंस्कृत हैं। Fibroblasts (CD146 -) व्यय करना और CD146 + कोशिकाओं के लिए केवल एल MSCs (CD146 +), सकारात्मक चयन की आबादी सुनिश्चित करने के लिए चुंबकीय मनका चयन के माध्यम से किया जाता है। सारांश में, इस प्रक्रिया को मज़बूती से आगे इन विट्रो अध्ययन और हेरफेर के लिए प्राथमिक एल MSCs की आबादी पैदा करता है। प्रोटोकॉल की प्रकृति के कारण, यह आसानी से अन्य प्रयोगात्मक पशु मॉडल में अनुवाद किया जा सकता है।

MSCs, घनत्व और प्लास्टिक पालन का सबसे विश्वसनीय शारीरिक विशेषताओं में से दो, फेफड़ों कि एल MSCs होता है की mesenchymal सेल अंश प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में उपयोग किया जाता है। हालांक?...

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Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

इस प्रोटोकॉल, चूहों से प्राथमिक फेफड़ों निवासी mesenchymal stromal कोशिकाओं को प्राप्त करने enzymatic पाचन, घनत्व ढाल जुदाई, प्लास्टिक पालन और CD146 + चुंबकीय मनका चयन के उपयोग के माध्यम के लिए एक अलग तकनीक का वर्णन करता है।

CD146 के अलगाव<sup&gt; +</sup&gt; चूहा फेफड़ों से निवासी फेफड़े mesenchymal stromal कोशिकाओं

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

अलगाव पशु और मानव नाल की रस्सी के सीरम फ्री विस्तार Mesenchymal stromal कक्ष (MSCs) और Endothelial कालोनी बनाने के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) व्युत्पन्न

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

अलगाव और चूहा mesenchymal स्टेम सेल के संवर्धन (MSCs) और एकल कॉलोनी के पृथक्करण MSCs व्युत्पन्न

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

अलगाव और Hoechst की विशेषता कम</supCD45> नकारात्मक फेफड़े mesenchymal स्टेम सेल माउस

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

अलगाव और भेदभाव Stromal संवहनी कोशिकाओं की Beige / Brite कोशिकाओं को

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

वयस्क माउस छेनी से चिकित्सकीय उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

एक प्रौढ़ चूहा दिल से उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल सेल और फाइब्रोब्लस्ट्स के साथ-अलगाव

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए मानव फेफड़े उपकला पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव और संवर्धन

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

सीए2 + क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम करंट के एक साथ माप के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स का अलगाव

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...