Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00
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JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa (animal ética protocolo Ohri-1696). cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. 1. Isolamento de células estromais mesenquimais do pulmão <ol><li> Preparar a mistura de enzima em um tubo de 50 ml: pesar 30 U protease neutra, 2.500 U de colagenase I e 500 U DNAse I. Estas quantidades suficientes para os pulmões de um rato adulto ou filhote de rato. ...

O isolamento e cultura de principal L-MSCs apresenta uma oportunidade para entender melhor a sua função ea sua interacção com outras populações de células em um nível celular, e seu papel no desenvolvimento do pulmão, a saúde ea doença. Isto é especialmente importante porque a falta de um marcador único específica destas células faz com que seja quase impossível para estudar estas células in situ. Tal como acontece com todas as populações de células primárias, deve-se ter em mente que estas...

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Durante o desenvolvimento, incluindo o pulmão, o mesênquima é uma importante fonte de sinais de desenvolvimento, e as MSCs residentes é um candidato provável para estar no centro desta. Além disso, estão surgindo evidências de que MSCs residentes são perturbados em doenças de adultos, incluindo o cancro 1,2 e fibrose 3. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células 4. Células-tronco antigénio-1 (Sca-1) foi identificada em ratos como um marcador para uma variedade de células estaminais do tecido, e pode ser utilizado para o isolamento de MSCs de L-5, mas tem infelizmentenão conhecido orthologs em outras espécies 6. Os investigadores relataram uma variedade de diferentes métodos de isolamento para o isolamento de L-MSCs a partir de qualquer tecido ou fluido pulmonar. Estes variam de células activadas por fluorescência (FACS) modos baseados selecionando para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) - / Sca-1 + células 8, a resistência a múltiplos fármacos transportador ATP cassete de ligação G (ABCG2) células positivas 9 ou Hoechst 33342 dye efluxo 10, a aderência ao plástico 11,12 e migração para fora do tecido picada 13. As vantagens do método aqui apresentado são várias vezes. Usando uma digestão enzimática suave e em gradiente de densidade 14, obtém-se todas as células da gama de densidades que incluem MSC, mas excluem células epiteliais ou endoteliais. O passo subsequente aderência ao plástico assegura que apenas o mesenchcélulas ymal aderir e ficar em cultura, eliminando leucócitos. Mais importante, no entanto, o passo de selecção CD146 + permite a eliminação de fibroblastos, uma vez que estas células não expressam CD146. Expressão da molécula de adesão celular CD146 é positivamente correlacionada com multipotency, e por isso é um bom marcador para eliminar os fibroblastos a partir de uma população de células mesenquimais 15-19. Esta é uma vantagem sobre o uso de CD90 como um marcador de selecção, uma vez que não só é expressa no MSC, mas também em lipofibroblasts 5,20. Neste protocolo, escolheu explicitamente uma selecção esfera magnética, uma vez que é mais suave sobre as células, e todo o processo pode ser realizado em condições estéreis. Outra vantagem importante do método de isolamento, em oposição ao método de crescimento, é de que é relativamente rápido, 6-10 dias, em oposição a um mês ou mais para o método de desdobramento. Três a cinco dias após o isolamento inicial da população mesenquimal está pronto para CD146 + sele<html> cção; depois de mais de três a cinco dias, as células CD146 + está pronto para ser usado nas experiências, ou pode ser congelado para posterior utilização. O tempo de diminuição de cultura, melhora a qualidade das células como as MSCs transdiferenciar em direcção fibroblastos em cultura ex vivo prolongada 19. Por último, devido à natureza do protocolo, é possível aplicar este método para outras espécies simplesmente escolhendo anticorpos adequados, ou mesmo com outros sistemas de órgãos, ajustando a escolha de enzimas de digestão e tempo de incubação. Um protocolo detalhado deste método de isolamento é dada a seguir, e uma vista geral esquemática do isolamento e subsequente selecção da sub-população CD146 + é fornecida na Figura 1A e 1B, respectivamente. Além disso, os detalhes são incluídos para Passaging, congelamento e descongelamento estas células. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visão esquemática do isolamento de células pulmonares mesenquimais (A) e CD146 + subsequente selecção de células (B) min = minuto.; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; 2 nd Ab = anticorpo secundário; a-CD146 Ab = anticorpo anti-CD146 primário; células negativas -ve = células CD146; + ve células positivas células = CD146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Além disso, é provável que têm um papel no desenvolvimento normal do órgão, e foram papéis na doença, particularmente aqueles com uma natureza fibrótica atribuída. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células. A técnica de isolamento descritas aqui se aplica múltiplas características de MSCs residentes de pulmão (L-MSCs). No momento do sacrifício dos ratos, os pulmões são removidos e enxaguados várias vezes para remover o sangue. Após dissociação mecânica por bisturi, os pulmões são digeridos durante 2-3 hr usando uma mistura de colagenase de tipo I, tipo protease neutra e ADNase I. A obtainesuspensão de células única d é subsequentemente lavado e colocado em camadas sobre média densidade gradiente (densidade 1,073 g / ml). Após centrifugação, as células da interfase foram lavadas e plaqueadas em frascos tratados de cultura. As células são cultivadas durante 4-7 dias em fisiológico 5% de O2, 5% Condições de CO 2. Para esgotar fibroblastos (CD146 -) e para assegurar uma população de apenas, a selecção positiva de L-MSCs (CD146 +) para células CD146 + é realizado por meio de selecção esférulas magnéticas. Em resumo, este processo produz uma população de forma fiável primária G-MSC para posterior estudo e manipulação in vitro. Devido à natureza do protocolo, que pode facilmente ser convertidos a outros modelos animais experimentais.

Duas das características físicas mais fiáveis ​​de MSC, densidade e aderência ao plástico, são usadas na primeira parte deste protocolo para obter a fracção de células mesenquimais do pulmão que contém L-MSCs. Embora a interfase em gradiente de densidade incluem monócitos e macrófagos, além de células mesenquimais do pulmão, a aderência ao plástico seguido de 3-5 dias de cultura garante que apenas as células mesenquimais do pulmão permanecem. Na verdade, esta popu...

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Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biologia

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

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Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

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