Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Все процедуры были одобрены Animal Care комитета Университета Оттавы (протокол животное этика Ohří-1696) по. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам. 1. Выделение легких мезенхимальных стромальных клеток <ol><li> Подготовьте смеси фермент...

Выделение и культура первичной L-МСК дает возможность лучше понять их функции и их взаимодействие с другими клеточных популяций на клеточном уровне, и их роль в развитии легких, здоровья и болезни. Это особенно важно, поскольку отсутствие конкретного одного маркера этих клеток делает п...

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Во время разработки, в том числе в легких, мезенхима является важным источником сигналов развития и резиденты МСК являются вероятным кандидатом, чтобы быть в центре этого. Кроме того, доказательства вытекает что МСК резиденты возмущается у взрослых заболеваний, в том числе рака 1,2 и фиброза 3. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток 4. Стволовыми клетками антигена-1 (Sca-1) был идентифицирован у мышей в качестве маркера для различных стволовых клетках тканевой, и может быть использован для изоляции L-МСК 5, но имеет, к сожалению,нет известных ортологи у других видов 6. Исследователи сообщили различные методы изоляции для изоляции L-МСК с любой ткани легкого или жидкости. Они варьируются от клеток с возбуждением флуоресценции сортировки (FACS), основанные методы селекции CD31 - / CD45 - / CD90 + клетки 7, CD31 - / CD45 - / эпителиальных молекула клеточной адгезии (EpCAM) - / SCA-1 + клеток 8, множественная лекарственная устойчивость транспортер АТФ связывающего кассетного G (ABCG2) позитивные клетки 9 или Hoechst 33342 отток красителя 10, к пластической присоединения 11,12 и миграции из рубленого ткани 13. Преимущества настоящего документа представлены метода несколько раз. При использовании нежный ферментативного расщепления и градиент 14 плотности, получаем все клетки диапазоне плотностей, которые включают МСК, но исключают эпителиальные или эндотелиальные клетки. Последующее пластиковые шаг соблюдение гарантирует, что только mesenchymal клетки придерживаться и остаться в культуре, устраняя лейкоциты. Но самое главное, этап выбора CD146 + позволяет устранить фибробластов, так как эти клетки не экспрессируют CD146. Экспрессия молекул клеточной адгезии CD146 положительно коррелирует с мультипотентность, и поэтому является хорошим маркером, чтобы отсеять фибробласты из популяции мезенхимальных клеток 15-19. Это является преимуществом по сравнению с использованием CD90 качестве селективного маркера, как это выражается не только в МСК, но также и в lipofibroblasts 5,20. В этом протоколе мы явно выбраны магнитное выбор шарик, как это мягче на клетках, и вся процедура может быть сделано в стерильных условиях. Другим важным преимуществом этого способа выделения, в отличие от метода выроста, является то, что сравнительно быстро, 6-10 дней, в отличие от месяца или более для метода вырост. От трех до пяти дней после первоначальной изоляции популяция мезенхимальных готов к CD146 + Селе<html> ие; еще через три-пять дней CD146 + клетки готовы для использования в экспериментах или могут быть заморожены для дальнейшего использования. Уменьшилось время культуры улучшает качество клеток, как МСК трансдифференцироваться направлении фибробластов в длительной экс естественных культуры 19. Наконец, из-за природы протокола, можно применить этот метод к другим видам просто выбрав соответствующие антитела, или даже другие системы органов, регулируя выбор пищеварения ферментов и времени инкубации. Подробный протокол такого способа выделения приводится ниже, и схематическое представление выделения и последующего отбора CD146 + субпопуляции обеспечивается на фиг.1А и 1В соответственно. Кроме того, данные включены для пассирования, замораживания и оттаивания эти клетки. Объявление / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1. Схема обзор изоляции легочных клеток мезенхимальных (А) и последующей CD146 + клеточной селекции (B) = мин минут. ЭДТА = этилендиаминтетрауксусная кислота; 2-й Ab = вторичное антитело; альфа-CD146 AB = первичное антитело анти-CD146; ве клетки = CD146 негативные клетки; положительной клетки = CD146-положительные клетки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Кроме того, они, вероятно, играют определенную роль в нормальном развитии органов и были приписаны роли в болезни, особенно с фиброзной природой. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток. Метод выделения описано здесь применяется несколько характеристик МСК резидентов легких (L-МСК). После умерщвления крыс, легкие удаляют и промывают несколько раз, чтобы удалить кровь. После механической диссоциации скальпелем, легкие перевариваются в течение 2-3 ч, используя комбинацию типа коллагеназы I, нейтральной протеазы и типа ДНКазы И. obtaineд сингл клеточную суспензию затем промывали и наслаивали на градиент плотности среде (плотность 1,073 г / мл). После центрифугирования клетки из интерфазы промывают и высевают в культуральных колбах обработанных. Клетки культивировали в течение 4-7 дней в физиологическом 5% O 2, 5% СО 2 условия. Чтобы истощить фибробласты (CD146 -) и обеспечить население только L-МСК (CD146 +), позитивной селекции для CD146 + клеток осуществляется через магнитное отбора борта. Таким образом, эта процедура надежно производит население первичной L-МСК для дальнейшего изучения и манипулирования в пробирке. Из-за природы протокола, он может быть легко переведено в других экспериментальных моделях на животных.

Два из наиболее надежных физических характеристик МСК, плотности и пластиковой присоединения, используются в первой части этого протокола для получения мезенхимальных клеточной фракции легкого, который содержит L-МСК. Хотя градиент плотности межфазного войдут моно?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Этот протокол описывает методику изоляции для получения мезенхимальных стромальных клеток первичных резидентные легких у крыс, посредством использования ферментативного расщепления, разделения в градиенте плотности, пластической адгезии и CD146 + магнитного отбора борта.

Выделение CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident легких мезенхимальных стромальных клеток крысы легких

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Выделение и Обогащение Крыса мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и разъединении одной колонии Производные МСК

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Одновременная изоляция высококачественных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов от сердца взрослых крыс

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...