Name: isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Alla förfaranden godkändes av Animal Care kommittén vid universitetet i Ottawa (djuretik protokoll Ohří-1696). Djurvård utfördes i enlighet med institutionens riktlinjer. 1. Isolering av Lung mesenkymala stromaceller celler <ol><li> Förbered enzymblandningen i en 50 ml tub: väga in 30 U neutralt proteas, 2500 U kollagenas I och 500 U DNAse I. Dessa belopp räcker för lungorna hos en vuxen mus eller råtta valp. Förbereda på dag av isolering och förvara vid 4 ° C fram till anv...

Den isolering och odling av primär L-MSC innebär en möjlighet att bättre förstå deras funktion och deras interaktion med andra cellpopulationer på cellnivå, och deras roll i lungutveckling, hälsa och sjukdom. Detta är särskilt viktigt eftersom det saknas en specifik enskild markör för dessa celler gör det nästan omöjligt att studera dessa celler in situ. Som med alla primära cellpopulationer, bör man ha i åtanke att dessa celler är mer benägna att ändra sin karaktär ju längre de hålls i...

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Under utveckling, bland annat i lungan, är mesenkym en viktig källa till utvecklings ledtrådar, och bosatta MSC är en trolig kandidat för att stå i centrum för detta. Dessutom är bevis fram som bosatta MSC störs hos vuxna sjukdomar, inklusive cancer 1,2 och fibros 3. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler 4. Stamcellantigen-1 (Sca-1) identifierades i möss som en markör för en mängd olika vävnads stamceller, och kan användas för isolering av L-MSC 5, men har tyvärringen känd ortologer i andra arter 6. Forskare har rapporterat en mängd olika isoleringsmetoder för isolering av L-MSC från antingen lungvävnad eller vätska. Dessa varierar från fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) baserade metoder selektering för CD31 - / CD45 - / CD90 + celler 7, CD31 - / CD45 - / epitelial celladhesionsmolekyl (EpCAM) - / Sca-1 + -celler 8, multidrogresistens transportör ATP-bindande kassett G (ABCG2) positiva celler 9 eller Hoechst 33342 färgämne efflux 10, till plast vidhäftning 11,12 och migration av malet vävnad 13. Fördelarna med den häri presenterade förfarandet är flerfaldigt. Genom att använda en mild enzymatisk spjälkning och densitetsgradient 14, erhåller man alla celler i densitetsintervallet som inkluderar MSCs men utesluter epitelceller eller endotelceller. Den efterföljande plast vidhäftning steg säkerställer att endast mesenchymal celler vidhäftar och bo i kultur, vilket eliminerar leukocyter. Viktigast dock tillåter CD146 + val steg för eliminering av fibroblaster, eftersom dessa celler inte uttrycker CD146. Expression av celladhesionsmolekylen CD146 är positivt korrelerad med multipotens, och är därför en bra markör för att sålla ut fibroblaster från en mesenkymal cellpopulation 15-19. Detta är en fördel jämfört med användning av CD90 som en selektionsmarkör, eftersom det inte är bara uttrycks i MSC: er utan också i lipofibroblasts 5,20. I detta protokoll har vi uttryckligen valt en magnetisk pärla urval, eftersom det är skonsammare på cellerna, och hela proceduren kan ske under sterila förhållanden. En annan viktig fördel med denna isoleringsförfarandet i motsats till utväxt metoden, är att det är relativt snabbt, 6-10 dagar i motsats till en månad eller mer för utväxt metoden. Tre till fem dagar efter den första isoleringen av mesenkymala befolkningen är redo för CD146 + sele<html> ction; efter ytterligare tre till fem dagar de CD146 + cellerna är redo att användas för försöken eller kan frysas för senare användning. Den minskade tiden för kultur förbättrar kvaliteten på celler som MSCs transdifferentiera mot fibroblaster i förlängd ex vivo kultur 19. Slutligen, på grund av den typ av protokoll är det möjligt att tillämpa denna metod på andra arter genom att helt enkelt välja lämpliga antikroppar, eller till och med till andra organsystem genom att justera valet av matsmältningsenzymer och inkubationstiden. En detaljerat protokoll av denna isolering metod ges nedan och en schematisk översikt av isolering och efterföljande selektion av CD146 + subpopulation ges i figur 1A och 1B respektive. Dessutom är uppgifter ingår för passage, frysning och upptining dessa celler. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Schematisk översikt av isolering av lung mesenkymala celler (A) och efterföljande CD146 + cellval (B) min = minuter.; EDTA = etylendiamintetraättiksyra; 2 nd Ab = sekundär antikropp; a-CD146 Ab = primär anti-CD146-antikropp; ve celler = CD146 negativa celler; + ve celler = CD146 positiva celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="664">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Neutral Protease</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS02104</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:120px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:61px;">LS004196</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">DNAse I</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">D5025</td>
			<td style="width:309px;">Prepare on day of isolation and store at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td>
			<td style="width:120px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">Dulbecco&#8217;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">14287-072</td>
			<td style="width:309px;">Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:175px;">Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:61px;">17-5446-52</td>
			<td style="width:309px;">Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &#62;45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:61px;">M8042</td>
			<td style="width:309px;">Warm in 37oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">25030-164</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">100x Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">15240-062</td>
			<td style="width:309px;">Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">M-280 Dynabeads</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">11205D</td>
			<td style="width:309px;">Magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:175px;">biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:120px;">Dako, Agilent Technologies</td>
			<td style="width:61px;">E0464</td>
			<td style="width:309px;">Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">DynaMag5-magnet</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12303D</td>
			<td style="width:309px;">Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&#8217;s instructions of the magnet beads of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:175px;">TrypLE express&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:61px;">12605-028</td>
			<td style="width:309px;">Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">anti-rat CD146 antibody</td>
			<td style="width:120px;">Lifespan Biosciences Inc.</td>
			<td style="width:61px;">C35841</td>
			<td style="width:309px;">12.5 &#956;l per 0.5 x 106 cells</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:175px;">Pentaspan (pentastarch solution)</td>
			<td style="width:120px;">Bristol-Myers Squibb Canada</td>
			<td style="width:61px;">-</td>
			<td style="width:309px;">Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Mr.Frosty freezing container</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:61px;">5100-0001</td>
			<td style="width:309px;">Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Dessutom är de sannolikt har en roll i normal organutveckling, och har tillskrivits roller i sjukdomar, särskilt de med en fibrotisk natur. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler. Isoleringen teknik som beskrivs här gäller flera egenskaper hos lung bosatta MSC (L-MSC). Vid offer råttorna, är lungorna avlägsnas och sköljs flera gånger för att tvätta bort blodet. Efter mekanisk dissociation av skalpell, är lungorna digererades under 2-3 h med användning av en blandning av kollagenas typ I, neutralt proteas och DNase typ I. obtained enkelcellsuspension tvättas därefter och skiktades över densitetsgradient-medium (densitet 1,073 g / ml). Efter centrifugering, är celler från interfas tvättades och ströks ut i odlingsbehandlade kolvar. Cellerna odlas under 4-7 dagar i fysiologisk 5% O2, 5% CO2 villkor. Att utarma fibroblaster (CD146 -) och för att säkerställa en population av endast L-MSC: er (CD146 +), positiv selektion för CD146 + -celler utförs genom magnetisk pärla val. Sammanfattningsvis, detta förfarande på ett tillförlitligt sätt ger en population av primär L-MSC för vidare in vitro-studier och manipulation. På grund av arten av protokollet, kan det lätt översättas till andra experimentella djurmodeller.

Två av de mest pålitliga fysiska egenskaperna hos MSC, densitet och plast vidhäftning, används i den första delen av detta protokoll för att erhålla mesenkymala cellfraktionen i lungan som innehåller L-MSC. Även om densitetsgradient inter inkluderar monocyter och makrofager förutom lunga mesenkymala celler, plast vidhäftning följt av 3-5 dagars odling säkerställer att endast de lung mesenkymala celler kvar. I själva verket denna cellpopulation uttrycker den klassiska MSC y...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Detta protokoll beskriver en isolerings teknik för att erhålla primära lung bosatta mesenkymala stromaceller från råttor, genom användning av enzymatisk nedbrytning, densitetsgradient separation, plast vidhäftning och CD146 + magnetisk pärla urval.

Isolering av CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenkymala stromaceller celler från råttlungor

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolering och Animal Serum Fri ökningen av mänsklig Navelsträngen Härledda mesenkymala stromaceller (MSC) och Endothelial kolonibildande progenitorceller (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolering och anrikning av Rat mesenkymala stamceller (MSC) och separation av Single-koloni Derived MSC

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolering och karakterisering av Hoechst Låg CD45 Negativa Mus Lung mesenkymala stamceller

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering och differentiering av stromal vaskulära celler till beige / Brite celler

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Samtidig isolering av högkvalitativa kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster från ett vuxen råtthjärta

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering och anrikning av humana lungepitelceller för organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter för samtidiga mätningar av Ca2+ transienter och kalciumström av L-typ

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...