Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
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Diese Arbeit wurde von der NINH unterstützt gewähren R01MH097949 und die Autism Speaks Pilot Grants 7359 zu BWL und der Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Geteilt Instrumentation Grants P30CA023108.

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	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt einige wichtige Schritte, die wichtig für eine erfolgreiche virale Verpackungs sind. Zellgesundheit ist entscheidend vor und während der Transfektion, als ungesund Zellen wird die Menge des Virus produziert erheblich reduzieren. Wenn die Transfektionseffizienz und Verpackungs erfolgreich sind, dann werden 100% der Zellen sollte das Fluorophor exprimieren und die Zellen sollten eine funktionelle Syncytium bilden. In Schritt 3.2.4 wird das Rohr Klopfen notwendig hochtitrige Transfektion effizient, und der pH-Wert der HEPES-gepufferter Kochsalzlösung muß exakt sein. Die Maxi-Preps, die die Plasmide, die für die virale Verpackung produzieren muss extrem rein sein. Bis zu diesem Punkt ist es hilfreich, die endgültige DNA Elution zu Ethanol ausfällen und in Tris-EDTA-Puffer erneut suspendieren. Es ist auch sehr wichtig, die Menge an Serum zu 2% oder weniger in den Medien zu verringern, dass das Coffein an Tag 6 zugegeben wird (Schritt 3.4) vor viral Sammlung. Wenn das Serum nicht reduziert wird, dann ist die endgültige gereinigte Virus wird eine unerwünschte Menge an Serum enthalten protein. Die Verwendung von Polyethylenglykol 6000, wenn die viralen Partikel Ausfällen schließt die Notwendigkeit Ultrazentrifugation. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Cas9 CRISPR Viren enthalten typischerweise einen Titer etwa 10-fach weniger als Viren nur ein Fluorophor enthält. Für die Operation stereotaxische ermöglicht die Verwendung von inhalativen Anästhesie eine schnelle und präzise Kontrolle oder das Bewusstsein des Tieres im Vergleich zu injizierbaren Anästhetika und ermöglicht Anästhesie über einen größeren Altersbereich. Es ist sehr wichtig, dass die chirurgischen Instrumente sauber und steril zu halten und reproduzierbare Ausrichtung erfordert eine genaue Positionierung des Kopfes. Stellen Sie sicher, dass kein Nicken oder Rollen des Kopfes in der stereotaktischen Instrument ist und dass der Schädel fühlt sich fest an seinem Platz. Es kann sinnvoll sein, den Schädel zu ermöglichen, zu trocknen, um die Nähte zu finden, die Koordinaten stereotaxische zu bestimmen. Auch sollte die Rate und das Volumen für jeden werden stereotaktischen Koordinaten empirisch ermittelt. Diese Technik ist die Begrenzung, dass die Ausbreitung eines Retrovirus lenti- oder eingeschränkt ist, insbesondere im Vergleich zu den adeno-assoziierten Viren (AAV) .Daher Diese Viren sind wertvoll, wenn ein diskretes Hirnregion Infizieren, aber nicht für die Gesamt Infektion mit AAV für Verhaltensanalyse bei Tieren angewandt werden. Die Verwendung von Coffein in diesem Protokoll erhöht die Titer dieser Viren, aber sie sind immer noch nicht so hoch wie die in AAV Verpackung erreicht Titer. Auch die stabile Integration ist nur ein Vorteil von Fluorophor Ausdruck, als CRISPR / Cas9 stabile genomische Bearbeitungen sogar bildet, wenn transient und es ist möglich, dass die laufende Ausdruck des Cas9 und sgRNA kann schließlich Zielwirkungen ab. Die transiente Expression der CRISPR / Cas9 System mit AAV ausreichend genomische Veränderungen zu erzeugen, die im gesamten Zellteilungen propagiert werden, jedoch Fluorophore Ausdruck wird nicht aufrechterhalten werden. Erstellung von lenTi- und Retroviren die CRISPR / Cas9 System verwendet wird verleihen die Fähigkeit, jede neue Gen in einer Vielzahl von Organismen zu zielen. Die Effizienz des Gen-Bearbeitung wird in der Folge der Führungs RNA Targeting des Cas9 Spaltung abhängt. Es hat sich gezeigt, dass indels enthalten zwischen 10% und 80% der Klone empirisch bestimmt nach der Sequenzierung Neuro2A Zellen infiziert. Es ist derzeit nicht bekannt, ob indel Frequenzen berechnet in Neuro2A Zellen reflektiven von denen sind in Neuronen. Anleiten RNA-Design-Software wie Benchling umfassen nun einen &quot;on-target&quot; Punktzahl in der Lage sein kann, den Wirkungsgrad eines gegebenen Zielsequenz vorherzusagen. Inwieweit solche &quot;On-Target&quot; Scores sind zuverlässige Bedürfnisse empirisch in Neuronen und anderen Zelltypen als CRISPR-Cas9 System bestimmt werden wird breiter umgesetzt. Lentivirus-basierte transgenen Tierproduktion wurde mit Berichten variabel erfolgreich, dass die Lentivirus geliefert Transgene si gewordenlenced 11. CRISPR vermittelte Gen Bearbeitung von DNA kann durch die Keimbahn weitergegeben werden, um ganze Tiermodelle erzeugen. Somit können stabile genomische Bearbeitung trotz des Silencing von viralen Auslieferungs Fluorophore und Cas9 Transgene erreichbar sein. Dies kann eine effiziente Plattform für die gezielte genomische Veränderungen bieten. Die virale Lieferung des CRISPR / Cas9-System, während nicht transgenen Organismen erfordern, ist komplementär zu diesen Techniken. Zum Beispiel die Injektion solcher viralen Partikel in eine Verbindung transgenen Tier, das Cre und Cre induzierbar Transgene abhängige Opto- oder chemo genetischen Ausdruck sollten komplexe Studien über den Zusammenhang zwischen genetischen Manipulationen und neuronale Aktivität erleichtern. Ein zweites Beispiel ist diese Cas9 / sgRNA viralen Teilchen in eine bedingte knockout in einem Versuch, zu liefern, für die Gen-Gen-Interaktionen zu screenen. Schließlich ist eine weitere spannende Route dieser Forschung das Screening von Phänotypen und therapeutischen Verbindungen in Patienten gewonnenen Zellen, denenwerden verwendet, um genetische Netzwerke zu validieren und zu entdecken, die bei verschiedenen Erkrankungen gestört werden.

Auf der Grundlage einer normalen Physiologie und Krankheitspathologie untersuchen, besteht ein Bedarf an genau Genexpression in Modellorganismen manipulieren. Für Säugetiermodellorganismen, wird dies auf die Schaffung und Entwicklung von transgenen Mäusen weitgehend zentriert, wobei ein genetisches Element von Interesse von Websites durch eine Rekombinase erkannt flankiert wird. Dies kann in einer ortsspezifischen Manipulation dieser Gene flankiert führen. Zwar ist dies eine erfolgreiche Strategie gewesen ist, ist es an der Zeit und ressourcenintensiv; beispielsweise eine dreifache transgenes Tier zu schaffen, die eine floxed Gen, Cre-Rekombinase, und ein Cre-Reportergens erfordert mehrere Paarungen und Validierung ausdrücken würde. Im Gegensatz dazu , codierend die stereotaxische Injektion von replikationsdefekte virale Partikel ein fluoreszierendes Protein und das Rekombinase - Gen in ein floxed Tier erfordert keine komplexe Genotypisierung oder Zuchtstrategien 1. Wenn ein fluoreszierendes Protein und Cre exprimierenden Virus weiter ist mit einem zweiten Virus enco coinjiziertding ein anderes fluoreszierendes Protein, dann stellt dies eine Kontrolle im Gewebe für die gezielte genetische Manipulation. Während diese Strategie immer noch die Verwendung von Knock-in Tieren erfordert, viral vermittelter RNA basierte Strategien umgehen die Notwendigkeit für transgene Tiere. Zum Beispiel können stereotaktische Injektion von replikationsdefizienten Viren, die ein fluoreszierendes Protein und eine kurze haarnadel RNA (shRNA) kodieren verwenden die endogenen RNAi-Maschinerie der Zelle in einem starken Reduktion des Transkripts eines Gens von Interesse zu führen. Allerdings produzieren shRNA Strategien subtile Gen knock-downs oft zu bescheiden zellulären Phänotypen 2. Während ein knock-down physiologisch für heterozygote Gen Dysfunktion relevant mehr sein kann, die im Vergleich verringerte Robustheit zu einem Knock-out ist für phänotypische Entdeckung neuer Gene nicht ideal. Eine dritte Technik, die vor kurzem entstanden ist, die CRISPR (Clustered regelmäßig auf Abstand Short Palindromic Repeat) / Cas9 (CRISPR-assoziiertenProtein 9) System beruht auf der Expression von sowohl einer kleinen exogene RNA und DNA Schneid Enzyms. Das CRISPR / Cas9 System wurde aus dem prokaryotischen Immunsystem angepasst , die ein Verfahren zur Identifizierung von Fremd entwickelt, eindringende DNA von Viren und zum Abbau über die Cas9 Enzyms 3,4 - Targeting. Diese leistungsstarke Genom Schnitttechnik kann zur Erstellung von gezielten Deletionen, Insertionen und Mutationen verwendet werden; und das folgende Protokoll wird darlegen , wie Deletionen in einem Gen von Interesse zu machen , um seine Expression in vivo KO. Das Cas9 Enzym muss mit einer Führung RNA homolog zu der Region von Interesse und angrenzend an ein Gerüst RNA exprimiert werden. Knockout eines Gens unter Verwendung dieser Technik erfordert bei einer Stelle von Interesse Cas9 auf eine bestimmte Region im Genom unter Verwendung von synthetischen Führungs RNAs (sgRNA) und induziert Doppelstrangbrüche (DSBs) Targeting. Diese DSBs werden dann durch die endogene Zellreparaturmaschinerie über nicht-homologous end-joining (NHEJ), die le repariertAnzeige an indels , dass Mutationen Missense oder Unsinn erzeugen kann und somit einen Verlust von funktionellen Proteinexpression 5 erstellen. Da dieses System genomische Veränderungen produziert, es erfordert nur die transiente Expression des Cas9 und sgRNA. Jedoch ist es wünschenswert, eine stabile Fluoreszenzindikatorzellen und deren Nachkommen in dieser Weise manipuliert zu identifizieren. Lenti- und Retroviren haben den Vorteil der DNA von Interesse in die Wirtszellen stabil zu integrieren, die langfristigen Ausdruck erhalten und sind bis auf die Tochterzellen während der Mitose übergeben. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion und Herstellung von zwei Arten von replikationsdefekten, hohe Titer-Retroviren: das menschliche Immunschwäche-Virus abgeleitet lentivirale Partikel (Lentivirus) sowie auf Basis von murinen Maloney-Leukämie-Virus (Retrovirus). Während diese beiden Viren stabile Lage sind, unterstützen großer Transgene exprimieren, können die retroviralen Partikel nur in das Genom integrieren duRing Zellteilung mit dem Abbau der Kernhülle und kann daher als Werkzeug Zellen zu markieren und Geburtstermin 6 verwendet werden. Während Lentiviren für einen Ruf haben relativ niedrige Titer 7 ist, diese Methode, einschließlich der Verwendung von Coffein 8 während der viralen Sammlung produziert routinemßig Titern von 10 9 und 10 10 Partikel / ml. Ein weiterer Vorteil der lenti- und Retroviren ist die Toleranz für sehr große Einsätze. Die folgende Sammlung von Protokollen beschreibt das Verfahren für die lenti oder Retrovirus Gestaltung kodieren ein fluoreszierendes Reporter, sgRNAs und Cas9 das CRISPR / Cas9 System zu verwenden, DNA sowie exprimieren ein fluoreszierendes Protein zu modifizieren. Maus stereotaxische Neurochirurgie ist ein wertvolles Verfahren für Viren in vivo zu studieren Morphologie, Funktion und Konnektivität von infizierten Neuronen einzuspritzen. Virusinfektion in Neuronen können verwendet werden, um Expressionsspiegel über einen längeren Zeitraum von tim manipulierene, wie beispielsweise während der Entwicklung, und die Expression kann präzise durch die Verwendung von verschiedenen Arzneimittel induzierbare Systeme und spezifische Cre-Expression angetrieben gesteuert werden. Diese besondere Protokoll beschreibt, wie ein Virus zu injizieren eine sgRNA und Cas9 exprimieren im Gehirn eines erwachsenen Maus ein Gen von Interesse KO. Mäuse erholen sich sehr schnell von diesem Verfahren und die Expression des viralen Transgen kann innerhalb von 48 Stunden nach der Injektion zu sehen. Jedoch Fluorophor Ausdruck erscheint im Laufe von Wochen zu erhöhen, in einer nahezu maximalen Niveaus von 3 Wochen nach der Infektion resultiert. Mäuse, die virale stereotaktische Injektion unterziehen kann Verhalten, Elektrophysiologie oder morphologischen Untersuchungen verwendet werden. Insgesamt ist der Zweck dieser Verfahren zu demonstrieren, wie im erwachsenen Gehirn der Maus mit stereotaktischen Operation und ein Virus die Expression eines bestimmten sgRNA und Cas9 ein Gen Knockout.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
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			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
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		</tr>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

Nach dem &quot;Protokoll zur Auslegung eines Führer Strand (sgRNA) für CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, Oligos eine bestimmte Zielsequenz eingefügt werden in die PXL Klonierungsvektor stromabwärts des HU6 Promotor und stromabwärts einer Führungs RNA Gerüst unter Verwendung der BbsI Klonierungsstellen (Abbildung 1, Schritt 1). Diese sgRNA wird dann aus PXL ausgeschnitten und in die pRubi Rückgrat eingefügt unter Verwendung der BstBI und PacI Seiten (1, Schritt 2). Schließlich cloniert weiteres sgRNA in PXL kann in pRubi-Guide1 (Abbildung 1, Schritt 3), Targeting einen anderen Bereich des Gens und die Erhöhung der Chancen eines knockout über NHEJ stromabwärts von der ersten Führung angeordnet werden. Die Überprüfung der korrekten Konstrukte sollten durch Sequenzanalyse bestimmt werden. Sobald dieses Konstrukt hergestellt wird, kann es zu einem Virus, das das &quot;Protokoll für Retro / Lentivirale Produktion- CaPO 4-Methode&quot; nach verpackt werden. Erfolgreiche Verpackung wird durch eine Infektion des Virus in HEK293-Zellen, um bestätigten die v titriertirus. Wenn es kein Fluorophor Ausdruck ist dann gab es wahrscheinlich ein Fehler bei der Verpackung des Virus. 2 ist ein repräsentatives Ergebnis von 2 - Retroviren, ein GFP exprimieren und das andere exprimierenden mCherry, koinjiziert in den Gyrus dentatus der neonatalen Maus (7 Tage alt) und abzubildenden 21 Tage nach der Injektion. Markierung von Neuronen mit mCherry oder GFP ermöglicht morphologische Beurteilung verschiedener genetischer Manipulationen in demselben Gewebe, wobei ein Virus einen CRISPR / Cas9 vermittelten KO und der andere ein Kontrollvirus exprimieren kann, exprimieren ausschließlich ein Fluorophor. Stereotaktische Injektion ermöglicht eine präzise anatomische Selektivität wie durch die diskrete Infektion der beabsichtigten Koordinaten gezeigt, Gyrus dentatus. Wenn Hirnschnitten für eine Infektion zu analysieren, ist es wichtig, das umgebende Gewebe zu halten, bis es, dass die korrekte anatomische Region bestimmt ist, infiziert war. Wenn es keine Anzeichen einer Infektion ist, dann ist es möglich, dass die Injektion erfolgte in einer benachbarten Region eind können in den umliegenden Abschnitte identifiziert werden. Es kann auch hilfreich sein, die Nadelbahn zu finden, die genaue Injektionsbereich zu finden. VSVg pseudotypisierten Viren aus den Rändern des Gyrus dentatus selten verteilt , wenn sie in vivo injiziert werden , und neigen dazu , entlang der rostral / kaudal Achse infizierenden Zellen entlang der gesamten Gyrus dentatus zu verteilen, wie es durch 3D - Rekonstruktion analysiert (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Abb . 1: Klonierungsstrategie für die retroviralen pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR Plasmid Diese Strategie ist identisch für die FU-basierten lentiviralen Plasmide. sgRNA Oligos sind geglüht und eingefügt in PXL die Klonierungsstellen BsbI verwenden. Nach der Sequenzierung , um sicherzustellen , dass der sgRNA erfolgreich in PXL eingeführt wird, verdauen das Plasmid mit BstBI und PacI. Der Einsatz, der fallen gelassen wird aus (Black Box) wird dann in das virale zurück b geklonteine (schwarze gepunktete Linien) pRubi-Guide1 CRISPR. Ein zweiter sgRNA kann auch in PXL eingeführt werden und verdaut , um die PacI Enzym verwendet. Diese wird dann in den CRISPR Vektor pRubi-Guide1 geklont (rot gestrichelte Linien) die PacI - Stelle mit. Das resultierende Plasmid enthält dann beide Führungsstränge sowie die notwendigen viralen Elemente, Förderer und Fluorophore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Fig . 2: Retrovirale Injektion der Maus Gyrus dentatus exprimierenden Retroviren mCherry (rot) oder GFP (grün) wurden in den Gyrus dentatus einer p7 Maus injiziert. 21 Tage später wurden die Mäuse perfundiert und die Gehirne geschnitten und gefärbt für GFP und mCherry. (A) Ein 5 - fach Weitfeld - Fluoreszenzbild zeigt die prNTSCHEIDUNG der dentatus Injektion Gyrus und die Spezifität des Gyrus dentatus Körner Kennzeichnung Neuronen. Die Morphologie des Hippocampus kann über die Dapi (blau) Färbung sichtbar. Maßstabsbalken misst 200 um. (B) Ein 10fach Weitfeld - Fluoreszenzbild zeigt , dass diese hohen Titer Lentiviren eine große Anzahl von Zellen , deren Morphologie infizieren kann über Fluorophor Ausdruck zugegriffen werden. Maßstabsbalken misst 100 &amp; mgr; m. (C) Viren GFP oder mCherry exprimieren , wurden Co-Injections in die Gyrus dentatus. Mit einem System von Retroviren, kann man ein Virus verwenden, um eine genetische Manipulation von GFP markiert machen und eine andere Manipulation durch mCherry markiert, und dann einzelne oder additive Änderungen beurteilen aufgrund jedes Virus. Maßstabsbalken misst 10 &amp; mgr; m. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Abb . 3: Anatomische Ausbreitung von lentiviralen Injektion Stereotaktische Koinjektion<html> eines GFP-shPten Virus und einem mCherry Kontrollvirus in das Gehirn eines Erwachsenen Pten loxP / + Maus führte zu einer Ausbreitung des Virus entlang der gesamten rostral / Schwanzachse des Gyrus dentatus des Hippocampus. Dies wird in einer 3D - Rekonstruktion des Ausmaßes der Injektion gezeigt , in dem geschlossene Konturen der viralen Ausbreitung über 21 serielle Abschnitte zurückgeführt wurden (Z = 50 &amp; mgr; m / section) unter Verwendung von Rekonstruktionssoftware. Die Konturzeichnungen wurden dann ausgerichtet, die 3D-Bilder für die Volumen Quantifizierung zu erzeugen. Insgesamt virale Verbreitung ist in grün (Volumen = 54730800 &amp; mgr; m 3) und gezähnt lokalisierte Ausbreitung wird gezeigt in lila (Volumen = 27275200 &amp; mgr; m 3). Das Virus breitet sich entlang der Nadelbahn und das Corpus callosum an der Kreuzung der Nadelbahn zusätzlich die rostral / Schwanzachse des Gyrus dentatus zu füllen. Maßstabsbalken misst 200 um. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Supplemental Video 1. Design von sgRNAs retroviralen und lentiviralen Rückgrat zu klonen in. In dieser Syntheseführung RNA (sgRNA) Ausführungsbeispiel wird die genomische Sequenz von Maus CHD8 von NCBI heruntergeladen. Das Startcodon und Exon-Struktur werden dann in Vector NTI visualisiert. Dies ermöglicht es uns, die genomische Region um das erste Codierexon zu kopieren und diese Sequenz in Benchling eingeben. Benchling ermöglicht es uns, alle potentiellen sgRNAs in der Region zu visualisieren. Ferner wird nach der genomischen Region angibt, wir Eingang haben, zeigen Benchling wird uns die On-Target und Off-Target-Scores für jede Führungs RNA. Der Benutzer kann dann wählen Sie die Führung RNA mit den höchsten On- und Off-Target - Scores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">.)</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Forschung

Neurowissenschaften

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Rodent stereotaktischen Chirurgie und Tierschutz Outcome Verbesserungen für Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

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Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

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Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum<i&gt; über</i&gt; A Transcleral dorsalen Zugang

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Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

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The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...