Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נין להעניק R01MH097949 ואת Autism Speaks פיילוט גרנט 7359 כדי BWL ואת Instrumentation משותף דימות אופטי נוריס כותנה Cancer Center גרנט P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם כמה שלבים קריטיים שחשובים אריזת ויראלי מוצלחת. Cell בריאות היא קריטית לפני ובמהלך transfection, כמו תאים בריאים יפחיתו את כמות הנגיף מיוצרת מאוד. אם transfection ואריזה מצליחים, אז 100% של התאים צריכים לבטא את fluorophore והתאים צריך להקים syncytium פונקציונלי. בשלב 3.2.4, הקשה על הצינור הוא הכרחי transfection-כייל גבוה ביעילות, ואת ה- pH של תמיסת מלח HEPES שנאגרו חייב להיות מדויק. Maxi-preps המייצרים פלסמידים הדרושים אריזה ויראלי חייב להיות טהור מאוד. עד כה, זה מועיל כדי אתנול לזרז את elution DNA הסופי מחדש להשעות במאגר טריס-EDTA. זה גם מאוד חשוב להפחית את כמות בסרום עד 2% או פחות בתקשורת כי קפאין מתווסף ביום 6 (שלב 3.4) לפני אוסף ויראלי. אם בסרום לא מצטמצם, אז הנגיף המטוהר הסופי יכיל כמות רצויה של prot בסרוםעין. שימוש פוליאתילן גליקול 6000 כאשר מזרזים חלקיקים הנגיפיים כולל הכרח ultracentrifugation. כמו כן, חשוב לציין כי וירוסים המכיל Cas9 CRISPR בדרך כלל יש כייל סביב פי 10 פחות וירוסים אך ורק המכיל fluorophore. עבור הניתוח stereotaxic, השימוש בחומרי הרדמה נשאפים מאפשר שליטה מהירה ומדויקת או התודעה של החיה לעומת הרדמה בזריקות ומאפשר הרדמה על פני טווח גילאים גדול. חשוב מאוד לשמור על מכשירי ניתוח נקי וסטרילי, יחד עם מיקוד לשחזור דורש המיקום המדויק של הראש. ודא שאין התנדנדות או גלגול של הראש במכשיר stereotaxic וכי הגולגולת מרגישה במקומו. זה יכול להיות שימושי כדי לאפשר הגולגולת להתייבש כדי למצוא את התפרים כדי לקבוע את הקואורדינטות stereotaxic. כמו כן, שיעור ונפח לכל stereotaxic לתאם צריך להיקבע באופן אמפירי. טכניקה זו המגביל כי ההתפשטות של lenti- או רטרו-וירוס מוגבלת, במיוחד בהשוואת וירוסי adeno קשור (AAVs) .לכן, וירוסים אלה הם בעלי ערך כאשר מדביקים אזור במוח בדיד, אך לא עבור זיהום כולל קשור AAVs המשמש ניתוח התנהגות בבעלי חיים. שימוש קפאין בפרוטוקול זה מגדיל מאוד את כייל של וירוסים אלה, אך הם עדיין לא גבוהים כמו titers מושגת באריזת AAV. כמו כן, שילוב יציב הוא רק יתרון ביטוי fluorophore, כמו CRISPR / Cas9 טפסי עריכות גנומי יציבים גם כאשר transfected זמני ויתכן כי על-הולך ביטוי Cas9 ו sgRNA עשוי בסופו של דבר לייצר את השפעות היעד. הביטוי חולף מערכת CRISPR / Cas9 עם AAVs מספיקה כדי לייצר שינויים גנומית מופצים ברחבי חלוקות תא, לעומת זאת, ביטוי fluorophore לא יישמר. יצירת lenתדהמה ו רטרווירוסים ניצול מערכת CRISPR / Cas9 יהיה להקנות את היכולת למקד כל גן הרומן במגוון רחב של אורגניזמים. היעילות של עריכת גן נראית תלוי ברצף של RNA מדריך מיקוד מחשוף Cas9. זה כבר נקבע באופן אמפירי כי בין 10% ו -80% של שיבוטים מכילים indels לאחר רצף נגועים בתאי Neuro2A. זהו כיום ידועים אם תדרי indel מחושבים בתאי Neuro2A הם שיקוף של אלה בנוירונים. מדריך תוכנות עיצוב RNA כגון Benchling חברה כוללות ציון &quot;על היעד&quot; שעשויה להיות מסוגל לחזות את היעילות של רצף מטרה נתון. באיזו מידה &quot;על היעד&quot; כגון ציונים הם צרכימים ואמינים להיקבע באופן אמפירי בנוירונים ותא-סוגים אחרים כמערכת CRISPR-Cas9 הופך יושם באופן נרחב יותר. Lentivirus מבוסס ייצור חיים מהונדס כבר variably מוצלח עם דיווחים כי transgenes נמסר lentivirus להפוך סיlenced 11. עריכת גן CRISPR בתיווך של ה- DNA עשויה להיות מועברת דרך הקו ניבט ליצור מודלים של בעלי חיים שלמים. לפיכך, עריכת גנומי יציבה עשויה להיות ברת השגה למרות והשתקת fluorophores ויראלית נמסר transgenes Cas9. זה עשוי לספק פלטפורמה יעילה עבור שינויים גנומית ממוקדים. משלוח ויראלי של מערכת CRISPR / Cas9, ואילו מעתה אין צורך האורגניזם המהונדס, הוא משלים טכניקות אלה. לדוגמה, הזרקת חלקיקים נגיפיים כגון לתוך חיים מהונדס תרכובת inducibly מבטא opto- או הכימותרפיה הגנטי תלוי Cre ו Cre transgenes אמור להקל מחקרים מורכבים לתוך מערכת היחסים בין מניפולציות גנטיות הפעילות העצבית. דוגמה שנייה היא לספק אלה חלקיקים נגיפיים Cas9 / sgRNA לתוך בנוקאאוט מותנה בניסיון למסך אינטראקציות גן-גן. לבסוף, אחר מסלול מרגש של מחקר זה הוא ההקרנה של פנוטיפים ותרכובות טיפוליות תאים שמקורם בחולה, אשר יכולהלשמש כדי לאמת ולגלות רשתות גנטיות כי הם שיבשו במחלות שונות.

כדי ללמוד את הבסיס של פיזיולוגיה נורמלית והפתולוגיה מחלה, יש צורך לתמרן ביטוי גנים בדיוק אורגניזמים מודל. עבור אורגניזמים מודל יונקים, זה הוא מרוכז בעיקר על היצירה והפיתוח של עכברים מהונדסים שבו מרכיב גנטי של ריבית מוקף אתרים מוכרים על ידי recombinase. זה יכול לגרום מניפולציה אתר ספציפי של גנים ולצדו אלה. אמנם זה כבר אסטרטגיה מוצלחת, זה זמן ומשאבים רבים; למשל, יצירת חיים מהונדסים משולשים שיבטאו גן floxed, recombinase Cre, ואת גן כתב Cre דורשת הזדווגויות ואימות מרובות. לעומת זאת, הזרקת stereotaxic של שכפול חלקיקים נגיפיים פגומים קידוד חלבון פלואורסצנטי ואת recombinase לתוך חית גן floxed אינו מחייבים גנוטיפ מורכב או אסטרטגיות רבייה 1. יתר על כן, אם חלבון פלואורסצנטי ו Cre להביע וירוס הוא שיתוף מוזרק עם enco וירוס שנידינג חלבון פלואורסצנטי שונה, אז זה מספק שליטה בתוך הרקמות עבור המניפולציה הגנטית הממוקדת. בעוד אסטרטגיה זו עדיין דורש את השימוש בבעלי חיים עקום, אסטרטגיות מבוססות RNA בתיווך ויראלי לעקוף את הצורך חיות טרנסגניות. לדוגמא, הזרקת stereotaxic של וירוסים שכפולים מחסרת המקודדים חלבון פלואורסצנטי ו RNA מכבנה קצרה (shRNA) יכולה להשתמש מכונית RNAi אנדוגני של התא כדי לגרום לירידה חזקה לפרוטוקול של גן של עניין. עם זאת, אסטרטגיות shRNA לייצר דפיקה ומורדות גן עדין ופעמים רבות תוצאת פנוטיפים הסלולר צנוע 2. בעוד למטה דפיקה עשוי להיות רלוונטי יותר פיסיולוגי לטיפול באין גן הטרוזיגוטיים, חוסן הירד שלה לעומת פסק דפיקה אינו אידיאלי עבור גילוי פנוטיפי של גנים חדשים. טכניקה שלישית שנוצרה לאחרונה, CRISPR (באשכולות קבוע Interspaced חזור קצר Palindromic) / Cas9 (CRISPR הקשוריםחלבון 9) מערכת, מסתמך על הביטוי הן של RNA אקסוגניים קטן אנזים חיתוך DNA. המערכת CRISPR / Cas9 הותאמה ממערכת החיסון פרוקריוטים אשר פיתחו שיטה לזיהוי זרים, פולשים DNA מפני וירוסים ותוכנות מיקוד זה שעומד לעבור פירוק באמצעות האנזים Cas9 3,4. טכניקת עריכת הגנום עצמה זה יכול לשמש ליצירת מחיקות ממוקדות, הוספות, ומוטציות; ואת הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע מחיקות בתוך גן של עניין על מנת המפסיד יוצא ביטויו vivo. אנזים Cas9 חייב לבוא לידי ביטוי עם RNA מדריך הומולוגי אל האזור של עניין ורציף עם RNA פיגום. נוק של גן באמצעות טכניקה זו דורש מיקוד Cas9 לאזור מסוים בגנום באמצעות RNAs מדריך הסינטטי (sgRNA), ואת גרימת הפסקות גדילים כפולות (DSBs) באתר של עניין. DSBs אלה הם תוקנו לאחר מכן על ידי מכונות לתיקון תאים אנדוגני באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) אשר leמודעת indels שעשוי לייצר מוטציות missense או שטויות ולכן יכול ליצור פסד של ביטוי חלבון פונקציונלי 5. מכיוון שהמערכת הזו מייצרת שינויים גנומיים, זה רק דורש את הביטוי החולף של Cas9 ו sgRNA. עם זאת, רצוי אינדיקטור ניאון יציב כדי לזהות תאים וצאצאיהם המנוהלים באופן זה. יש Lenti- ו רטרווירוסים היתרון של שילוב הדנ&quot;א של עניין ביציבות לתוך התאים המארחים המקיימות ביטוי לטווח ארוך מועברים לתאי הבת במהלך מיטוזה. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב והייצור של שני סוגים של שכפול פגום, רטרווירוסים כייל גבוה: חלקיקי lentiviral נגזרות וירוס הכשל החיסוני האנושי (lentivirus) ואלה המבוססים על וירוס murine מאלוני לוקמיה (רטרו-וירוס). בעוד שני הנגיפים הללו מסוגלים לתמוך יציבה מביעה של transgenes הגדול, חלקיקי retroviral יכולים לשלב רק לתוך הגנום duחלוקת תא טבעת עם השפלה של מעטפת הגרעין, ולכן יכולה לשמש ככלי לתייג ולידת עדכני תאי 6. בעוד lentiviruses יש מוניטין של להיות נמוכה יחסית כייל 7, מתודולוגיה זו, ובכלל זה שימוש קפאין 8 במהלך איסוף ויראלי, מייצרת כותרות שגרתי של 10 9 ו -10 10 חלקיקים / מ&quot;ל. יתרון נוסף של lenti- ו רטרווירוסים הוא הסובלנות מוסיף מאוד גדול. האוסף של הפרוטוקולים הבאים מתאר את הליך תכנון lenti או רטרו-וירוס קידוד כתב ניאון, sgRNAs, ו Cas9 כדי לנצל את המערכת CRISPR / Cas9 לשנות DNA וכן להביע חלבון פלואורסצנטי. עכבר נוירוכירורגיה stereotaxic היא שיטת ערך להזרקת וירוסי in vivo ללמוד מורפולוגיה, פונקציה, וקישוריות של נוירונים נגועים. זיהום ויראלי בנוירונים יכול לשמש כדי לתפעל רמות ביטוי על פני תקופה ממושכת של טיםדואר, כגון במהלך התפתחות, וביטוי ניתן לשלוט במדויק על ידי השימוש במערכות שונות סמים מושרים וביטוי ספציפי מונע Cre. פרוטוקול מסוים זה מסביר כיצד להזריק וירוס בעת sgRNA ו Cas9 כדי המפסיד יוצא גן של עניין במוח של עכבר בוגר. עכברים להתאושש מהר מאוד מהליך זה וביטוי של transgene ויראלי ניתן לראות בתוך ההזרקה 48 שעות. עם זאת, הביטוי fluorophore מופיע להגדיל במשך שבועות וכתוצאה מכך רמות מקסימלי בסמוך 3 שבועות לאחר ההדבקה. עכברים לעבור הזרקת stereotaxic ויראלי יכול לשמש התנהגות, אלקטרופיזיולוגיה, או מחקרים מורפולוגיים. בסך הכל, המטרה של נהלים אלה היא להדגים כיצד מפסיד יוצא גן במוח העכבר הבוגר באמצעות ניתוח stereotaxic ו וירוס להביע sgRNA ספציפי Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

בעקבות &quot;פרוטוקול עיצוב Strand מדריך (sgRNA) עבור CRISPR / Cas9 רטרו-וירוס&quot;, oligos מיקוד רצף מסוים מוכנסים לתוך וקטור שיבוט PXL במורד הזרם של האמרגן hU6 או במורד של פיגום RNA מדריך שימוש באתרי שיבוט BbsI (איור 1, שלב 1). SgRNA זה הוא נכרת אז מן PXL ו מוכנס לתוך עמוד השדרה pRubi באמצעות אתרי BstBI ו פאצ&#39;י (איור 1, שלב 2). לבסוף, אחר sgRNA משובטים לתוך PXL ניתן למקם במורד הזרם של המדריך הראשון pRubi-Guide1 (איור 1, שלב 3), מיקוד לאזור אחר של הגן והגדלת הסיכוי בנוקאאוט דרך NHEJ. אימות של המבנים הנכונים צריכה להיקבע על ידי ניתוח רצף. ברגע מבנה זה הוא עשה, זה יכול להיות ארוז לתוך וירוס בעקבות &quot;פרוטוקול רטרו / Lentiviral Production- CaPO4 שיטה&quot;. אריזה מוצלחת אושר על ידי זיהום של וירוס לתוך HEK293 תאים כדי titer נirus. אם אין ביטוי fluorophore אז הנראה אירעה שגיאה במהלך האריזה של הנגיף. איור 2 הוא תוצאת נציג של 2 רטרווירוסים, GFP אחד להביע ואת mCherry לבטא אחרים, שיתוף מוזרק לתוך gyrus המשוננת של עכבר בילוד (7 ימים) צלם 21 ימים לאחר הזרקה. תיוג של נוירונים עם mCherry או GFP מאפשר הערכה מורפולוגית של מניפולציות גנטיות שונות באותה רקמה, שבו וירוס אחד יכול להביע CRISPR / Cas9 בתיווך KO ואת וירוס בקרה אחרים, להביע fluorophore בלבד. הזרקת Stereotaxic מאפשרת סלקטיביות אנטומיים מדויקות כפי שהודגם על ידי הזיהום הדיסקרטי של קואורדינטות המיועדות, gyrus המשוננת. כשמנתחים חלקים במוח לזיהום, חשוב לשמור הרקמה שמסביב עד שהוא נחוש כי האזור האנטומי הנכון היה נגוע. אם אין כל סימן של זיהום, אז זה אפשרי כי ההזרקה התרחשה אזור שכנהד ניתן לזהות בסעיפים שמסביב. זה גם יכול להיות מועיל כדי לאתר את מסלול מחט למצוא באזור ההזרקה המדויק. וירוסי Pseudotyped VSVG לעתים רחוקות פרושים של השולים של gyrus המשוננת כאשר הוא מוזרק in vivo, נוטה להתפשט לאורך תאי מדביק ציר המקוריים / זנב לאורך gyrus המשוננת כולו, כמו מנותח על ידי שחזור 3D (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> איור 1:. האסטרטגיה שיבוט עבור פלסמיד pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR retroviral אסטרטגיה זו היא זהה עבור פלסמידים lentiviral מבוססי FU. oligos sgRNA הם annealed ונוסף PXL באמצעות אתרי שיבוט BsbI. לאחר רצף על מנת להבטיח כי sgRNA מוכנס לתוך בהצלחה PXL, לעכל את הפלסמיד עם BstBI ו פאצ&#39;י. את הכנס כי הוא נשר (קופסא שחורה) הוא משובטים מכן לתוך ב ויראלי בחזרהאחד (שחור מנוקד קווים) pRubi-Guide1 CRISPR. SgRNA שני גם יכול להיות מוכנס לתוך PXL ולעכל החוצה באמצעות האנזים פאצ&#39;י. זה הוא משובטים מכן לתוך וקטור CRISPR pRubi-Guide1 (קווים מקווקווים אדום) באמצעות אתר פאצ&#39;י. הפלסמיד כתוצאה מכן מכיל שני גדילי מדריך כמו גם אלמנטים ויראלי הצורך, יזמים, ו fluorophores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> איור 2:. הזרקת retroviral של gyrus משוננת עכבר Retroviruses להביע mCherry (אדום) או GFP (ירוק) הוזרקו gyrus משוננת של עכבר P7. 21 ימים לאחר מכן העכברים היו perfused ואת המוח מחולק ומוכתם עבור GFP ו mCherry. (א) תמונת ניאון רחב בתחום 5X מציגה את יחסי הציבורecision של זריקת gyrus המשוננת ואת הספציפיות של נוירונים גרגיר gyrus משוננים תיוג. המורפולוגיה של ההיפוקמפוס ניתן לראות באמצעות מכתים DAPI (הכחול). סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. (ב) תמונה ניאון 10X רחב בתחום מוכיח כי lentiviruses כייל גבוה אלה להדביק מספר גדול של תאים מורפולוגיה אשר ניתן לגשת דרך ביטוי fluorophore. סרגל קנה מידה מודד 100 מיקרומטר. וירוסים (C) להביע GFP או mCherry היו שיתוף מוזרקים לתוך gyrus המשוננת. באמצעות מערכת של רטרווירוסים, אפשר להשתמש וירוס אחד לעשות מניפולציה גנטית כזו מאופיינת GFP ועוד מניפולציה בסימן mCherry, ולאחר מכן להעריך את השינויים יחידים או כתוסף בשל כל וירוס. סרגל קנה מידה מודד 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> איור 3:. האנטומי התפשטות הזרקת lentiviral coinjection Stereotaxic<html> של וירוס ה- GFP-shPten ו וירוס מלא mCherry לתוך המוח של אדם מבוגר PTEN loxP / + העכבר הביא התפשטות ויראלית לאורך הציר המקורי / זנב כולו של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס. הדבר בא לידי ביטוי שחזור 3D של מידת ההזרקה שבו נסגרה קווי מתאר של ההתפשטות ויראלית אותרו למעלה מ -21 קטעי סדרתי (Z = 50 מיקרומטר / קטע) באמצעות תוכנת שחזור. העתקים קונטור היו מיושרים אז כדי ליצור את תמונות 3D עבור כימות היקף. סה&quot;כ התפשטות ויראלית מוצגת בירוק (נפח = 54,730,800 מיקרומטר 3) וממרח משונן-מקומי מוצג סגול (נפח = 27,275,200 מיקרומטר 3). הווירוס מתפשט לאורך מסלול המחט ואת כפיס המוח בצומת של מסלול מחט בנוסף ממלא את ציר הזנב / המקורי של gyrus המשוננת. סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. les / ftp_upload / 53,783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; משלימה וידאו 1. עיצוב של sgRNAs לשבט לתוך עמוד השדרה retroviral ו lentiviral. ב RNA מדריך סינתטי זה למשל עיצוב (sgRNA), רצף הגנום של CHD8 העכבר להוריד מאתר צמח השדה. קודון ההתחלה ומבנה אקסון הם דמיינו אז וקטור NTI. זה מאפשר לנו להעתיק את האזור הגנומי סביב אקסון הקידוד הראשון וזן רצף זה לתוך Benchling. Benchling מאפשר לנו לדמיין כל sgRNAs הפוטנציאל באזור. יתר על כן, לאחר המציינת את האזור הגנומי יש לנו קלט, Benchling יראה לנו ציונים על-היעד מחוץ היעד עבור כל RNA מדריך. המשתמש יכול ולאחר מכן בחר את הרנ&quot;א מדריך עם עשרות מאזני וחוץ-היעד הגבוה ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

מכרסמים כירורגיה Stereotaxic ועל צער בעלי חיים שיפורים תוצאה של ההתנהגות Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

תכנון ויישום מערכת עצבים בסימולציות לגו רובוטים

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית<i&gt; דרך</i&gt; עורק התרדמה הפנימי

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

מסירת נוגדנים למוח מורנה באמצעות הסעה-משלוח משופר

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...