Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
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इस काम निन्ह द्वारा समर्थित किया गया R01MH097949 अनुदान और आत्मकेंद्रित BWL और नॉरिस कपास कैंसर केंद्र ऑप्टिकल इमेजिंग साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान P30CA023108 करने के लिए पायलट अनुदान 7359 बोलती है।

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सफल वायरल पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं। के रूप में अस्वस्थ कोशिकाओं बहुत उत्पादित वायरस की मात्रा कम हो जाएगा सेल स्वास्थ्य से पहले और अभिकर्मक के दौरान महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक और पैकेजिंग सफल रहे हैं, तो कोशिकाओं की 100% fluorophore व्यक्त करना चाहिए और कोशिकाओं को एक कार्यात्मक संकोश फार्म चाहिए। कदम 3.2.4 में, ट्यूब दोहन कुशलता से उच्च अनुमापांक अभिकर्मक के लिए आवश्यक है, और HEPES बफर खारा के पीएच सटीक होना चाहिए। मैक्सी preps कि वायरल पैकेजिंग के लिए आवश्यक plasmids उत्पादन अत्यंत शुद्ध होना चाहिए। इस बात के लिए, यह अंतिम डीएनए क्षालन वेग इथेनॉल के लिए और Tris-EDTA बफर में फिर से निलंबित सहायक है। यह भी है कि मीडिया कैफीन वायरल संग्रह से पहले दिन 6 (3.4 कदम) को जोड़ा जाता है में 2% या उससे कम करने के लिए सीरम की मात्रा को कम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। सीरम कम नहीं है, तो अंतिम वायरस शुद्ध सीरम prot की एक अवांछनीय राशि में शामिल होंगेein। पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 जब वायरल कणों precipitating के उपयोग की आवश्यकता ultracentrifugation शामिल नहीं है। यह भी ध्यान दें कि Cas9 CRISPR युक्त वायरस आम तौर पर 10 के आसपास एक अनुमापांक गुना केवल एक fluorophore युक्त वायरस की तुलना में कम है महत्वपूर्ण है। stereotaxic सर्जरी के लिए, साँस संज्ञाहरण के उपयोग के इंजेक्शन anesthetics की तुलना में तेजी से और सटीक नियंत्रण या जानवर की चेतना की अनुमति देता है और एक बड़ा आयु सीमा से अधिक संज्ञाहरण अनुमति देता है। यह अत्यधिक सर्जिकल उपकरणों को साफ और बाँझ रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्ष्य-निर्धारण सिर की सटीक स्थिति की आवश्यकता है। सुनिश्चित करें कि कोई पिचिंग या stereotaxic साधन में और खोपड़ी जगह में मजबूती का मानना ​​है कि सिर के रोलिंग वहाँ है सुनिश्चित करें। यह खोपड़ी आदेश stereotaxic निर्देशांक निर्धारित करने के लिए टांके खोजने के लिए शुष्क करने की अनुमति देने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, दर और प्रत्येक के लिए मात्रा stereotaxic समन्वय के अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। इस तकनीक में सीमित है कि एक lenti- या रेट्रोवायरस के प्रसार को सीमित रखा गया है, खासकर जब (AAVS) .Therefore एडिनो से जुड़े वायरस की तुलना में, इन वायरस जब एक असतत मस्तिष्क क्षेत्र को संक्रमित करने के लिए मूल्यवान हैं, लेकिन कुल मिलाकर संक्रमण के लिए नहीं AAVS के साथ जुड़े पशुओं में व्यवहार विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया। इस प्रोटोकॉल में कैफीन का उपयोग बहुत इन वायरस के अनुमापांक बढ़ जाती है, लेकिन वे अभी भी titers एएवी पैकेजिंग में हासिल रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, स्थिर एकीकरण, केवल fluorophore अभिव्यक्ति का एक फायदा है CRISPR / Cas9 रूपों के रूप में स्थिर जीनोमिक संपादन भी जब क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट और यह संभव है कि पर जा रहा है Cas9 और sgRNA की अभिव्यक्ति के अंत में लक्ष्य प्रभाव बंद उत्पादन हो सकता है। क्षणिक अभिव्यक्ति AAVS साथ CRISPR / Cas9 प्रणाली जीनोमिक परिवर्तन है कि कोशिका विभाजन के दौरान प्रचार कर रहे हैं का निर्माण करने के लिए पर्याप्त है, हालांकि, fluorophore अभिव्यक्ति बनाए रखा नहीं किया जाएगा। लेन का निर्माणतिवारी और CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग रेट्रोवायरस जीवों की एक विस्तृत विविधता में किसी भी उपन्यास जीन को निशाना बनाने की क्षमता प्रदान करेगा। जीन संपादन की दक्षता गाइड आरएनए Cas9 दरार को निशाना बनाने का क्रम पर निर्भर होता है। यह अनुभव से निर्धारित किया गया है कि 10% के बीच और क्लोन के 80% indels के बाद अनुक्रमण Neuro2A कोशिकाओं को संक्रमित होते हैं। यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या INDEL आवृत्तियों Neuro2A कोशिकाओं में गणना की न्यूरॉन्स में उन लोगों को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। ऐसे Benchling के रूप में गाइड आरएनए डिजाइन सॉफ्टवेयर अब एक &quot;पर लक्ष्य&quot; स्कोर कि किसी दिए गए लक्ष्य अनुक्रम की दक्षता की भविष्यवाणी करने में सक्षम हो सकते हैं शामिल हैं। क्या डिग्री इस तरह के &quot;पर लक्ष्य&quot; स्कोर और अधिक व्यापक रूप से लागू हो जाता है अनुभव से न्यूरॉन्स और CRISPR-Cas9 प्रणाली के रूप में अन्य सेल-प्रकार में निर्धारित किया जा करने के लिए विश्वसनीय जरूरत है। Lentivirus आधारित ट्रांसजेनिक पशु उत्पादन रिपोर्ट के साथ अस्थायित्व सफल रहा है कि lentivirus दिया ट्रांसजीन सी बन जाते हैं11 lenced। डीएनए के CRISPR मध्यस्थता जीन संपादन पूरे पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए रोगाणु लाइन के माध्यम से पारित किया जा सकता है। इस प्रकार, स्थिर जीनोमिक संपादन वायरल दिया fluorophores और Cas9 Transgenes के मुंह बंद करने के बावजूद प्राप्त किया जा सकता है। यह लक्षित जीनोमिक परिवर्तन के लिए एक कुशल मंच प्रदान कर सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली के वायरल वितरण, जबकि ट्रांसजेनिक जीवों की आवश्यकता नहीं है, उन तकनीकों का पूरक है। उदाहरण के लिए, एक यौगिक ट्रांसजेनिक जानवर है कि inducibly Cre और रचनात्मक निर्भर ऑप्टो या केमो-आनुवंशिक transgenes व्यक्त आनुवंशिक जोड़तोड़ और neuronal गतिविधि के बीच संबंधों में जटिल अध्ययन की सुविधा चाहिए में इस तरह के वायरल कणों इंजेक्शन। एक दूसरा उदाहरण जीन जीन बातचीत के लिए स्क्रीन करने के प्रयास में एक सशर्त नॉकआउट में इन Cas9 / sgRNA वायरल कणों वितरित करने के लिए है। अंत में, इस अनुसंधान के एक और रोमांचक मार्ग phenotypes और रोगी ली गई कोशिकाओं में चिकित्सकीय यौगिकों की स्क्रीनिंग, जो कर सकते हैमान्य है और आनुवंशिक नेटवर्क है कि विभिन्न रोगों में बाधित कर रहे हैं खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

सामान्य शरीर विज्ञान और रोग विकृति के आधार का अध्ययन करने के लिए, वहाँ ठीक मॉडल जीवों में जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की जरूरत है। स्तनधारी मॉडल जीवों के लिए, यह काफी हद तक निर्माण और ट्रांसजेनिक चूहों के विकास पर केंद्रित है जिसमें ब्याज की एक आनुवंशिक तत्व एक recombinase द्वारा मान्यता प्राप्त साइटों से घिरे है। यह इन घिरे जीन की एक साइट विशिष्ट हेरफेर में परिणाम कर सकते हैं। यह एक सफल रणनीति रही है, वहीं यह समय और संसाधन गहन है; उदाहरण के लिए, एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक जानवर है कि एक floxed जीन, Cre recombinase, और एक Cre रिपोर्टर जीन व्यक्त करेंगे बनाने के लिए कई matings और सत्यापन की आवश्यकता है। इसके विपरीत, प्रतिकृति की stereotaxic इंजेक्शन दोषपूर्ण वायरल एक floxed जीन जानवर में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और recombinase एन्कोडिंग कणों जटिल जीनोटाइपिंग या प्रजनन रणनीतियों 1 की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, अगर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रचनात्मक वायरस व्यक्त है एक दूसरे वायरस Enco साथ सह इंजेक्शनडिंग एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन, तो यह लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक के भीतर ऊतक नियंत्रण प्रदान करता है। इस रणनीति अभी भी तोड़े में जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है, जबकि virally मध्यस्थता आरएनए आधारित रणनीतियों ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए की जरूरत को नाकाम। उदाहरण के लिए, प्रतिकृति की कमी वायरस है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक छोटी बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) सांकेतिक शब्दों की stereotaxic इंजेक्शन ब्याज की एक जीन की प्रतिलिपि की एक शक्तिशाली कमी में परिणाम के लिए सेल की अंतर्जात आरएनएआई मशीनरी का उपयोग कर सकते हैं। हालांकि, shRNA रणनीतियों सूक्ष्म जीन तोड़े चढ़ाव अक्सर मामूली सेलुलर phenotypes 2 में जिसके परिणामस्वरूप उत्पादन। एक तोड़े नीचे अधिक physiologically विषमयुग्मजी जीन में शिथिलता के लिए प्रासंगिक हो सकता है, इसकी कमी आई है मजबूती एक नाकआउट की तुलना में उपन्यास जीन की प्ररूपी खोज के लिए आदर्श नहीं है। एक तीसरा तकनीक है कि हाल ही में उभरा है, CRISPR (नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराएँ संकुल) / Cas9 (CRISPR जुड़ेप्रोटीन 9) प्रणाली है, दोनों एक छोटा सा बहिर्जात आरएनए और डीएनए काटने एंजाइम की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली प्रोकार्योटिक प्रतिरक्षा प्रणाली, विदेशी की पहचान के वायरस से डीएनए पर हमले और Cas9 एंजाइम 3,4 के माध्यम से गिरावट के लिए यह लक्षित करने की एक विधि विकसित जिसमें से अनुकूलित किया गया था। इस शक्तिशाली जीनोम संपादन तकनीक लक्षित विलोपन, सम्मिलन, और म्यूटेशन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और निम्नलिखित प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करेंगे कैसे आदेश विवो में अपनी अभिव्यक्ति पीटकर करने में ब्याज की एक जीन में विलोपन बनाने के लिए। Cas9 एंजाइम एक गाइड आरएनए एक पाड़ शाही सेना के साथ ब्याज की क्षेत्र के मुताबिक़ और सन्निहित के साथ व्यक्त किया जाना चाहिए। एक जीन इस तकनीक का उपयोग कर के नॉकआउट जीनोम में एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए Cas9 को निशाना सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग कर, और ब्याज की एक साइट पर डबल असहाय टूटता है (DSBs) उत्प्रेरण की आवश्यकता है। ये DSBs तो गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) जो Le के माध्यम से अंतर्जात सेल की मरम्मत मशीनरी द्वारा मरम्मत कर रहे हैंindels कि missense या बकवास म्यूटेशन का उत्पादन हो सकता है और इसलिए कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति 5 का एक नुकसान बना सकते हैं करने के लिए विज्ञापन। क्योंकि इस प्रणाली जीनोमिक परिवर्तन पैदा करता है, यह केवल Cas9 और sgRNA के क्षणिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता है। हालांकि, यह एक स्थिर फ्लोरोसेंट सूचक कोशिकाओं और उनके वंशज इस तरीके में हेरफेर की पहचान करने के लिए वांछनीय है। Lenti- और रेट्रोवायरस स्थिरतापूर्वक मेजबान कोशिकाओं जो लंबे समय तक बनाए रखने और अभिव्यक्ति बँटवारा दौरान बेटी कोशिकाओं को पारित कर रहे हैं में ब्याज के डीएनए को एकीकृत करने का फायदा है। इस प्रोटोकॉल डिजाइन और दोषपूर्ण प्रतिकृति, उच्च अनुमापांक रेट्रोवायरस के दो प्रकार के उत्पादन का वर्णन करता है: मानव इम्यूनो वायरस निकाली गई lentiviral कणों (lentivirus) और murine मैलोनी ल्यूकेमिया वायरस (रेट्रोवायरस) के आधार पर उन। जबकि इन वायरस के दोनों बड़े transgenes की स्थिर व्यक्त समर्थन करने में सक्षम हैं, रेट्रोवायरल कणों केवल जीनोम डु में एकीकृत कर सकते हैंपरमाणु लिफाफा की गिरावट है, और इसलिए रिंग के साथ कोशिकाओं के विभाजन के लिए एक उपकरण लेबल करने के लिए और जन्म की तारीख कोशिकाओं 6 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि lentiviruses अपेक्षाकृत कम अनुमापांक 7, इस पद्धति, वायरल संग्रह के दौरान कैफीन 8 के उपयोग सहित होने के लिए एक प्रतिष्ठा है, नियमित तौर पर 10 9 और 10 10 कणों / एमएल के titers पैदा करता है। lenti- और रेट्रोवायरस का एक और लाभ यह बहुत बड़ी आवेषण के लिए सहिष्णुता है। प्रोटोकॉल के निम्न संग्रह एक Lenti डिजाइन या रेट्रोवायरस एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, sgRNAs, और Cas9 डीएनए को संशोधित करने के साथ ही एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एन्कोडिंग के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा। माउस stereotaxic न्यूरोसर्जरी विवो में वायरस को इंजेक्शन लगाने आकृति विज्ञान, समारोह, और संक्रमित न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। न्यूरॉन्स में वायरल संक्रमण टिम की एक विस्तारित अवधि में अभिव्यक्ति के स्तर में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइस तरह के विकास के दौरान के रूप में ई, और अभिव्यक्ति ठीक विभिन्न दवा inducible सिस्टम और विशिष्ट Cre संचालित अभिव्यक्ति के उपयोग के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इस विशेष प्रोटोकॉल है कि कैसे एक वायरस एक sgRNA और Cas9 व्यक्त एक वयस्क चूहे के मस्तिष्क में ब्याज की एक जीन पीटा लिए इंजेक्षन करने के लिए बताते हैं। चूहे इस प्रक्रिया और वायरल transgene की अभिव्यक्ति के 48 घंटे बाद इंजेक्शन के भीतर देखा जा सकता से बहुत जल्दी ठीक हो। हालांकि, fluorophore अभिव्यक्ति 3 सप्ताह के बाद संक्रमण से पास अधिक से अधिक स्तर में जिसके परिणामस्वरूप सप्ताह के पाठ्यक्रम पर बढ़ाने के लिए प्रकट होता है। चूहे कि वायरल stereotaxic इंजेक्शन से गुजरना व्यवहार, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, या रूपात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं के उद्देश्य प्रदर्शित करने के लिए stereotaxic सर्जरी और एक वायरस एक विशिष्ट sgRNA और Cas9 व्यक्त का उपयोग कर वयस्क माउस मस्तिष्क में एक जीन पीटा के लिए है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

&quot;CRISPR / Cas9 Retrovirus के लिए एक गाइड स्ट्रैंड (sgRNA) डिजाइनिंग के लिए प्रोटोकॉल&quot; के बाद, एक विशेष अनुक्रम को निशाना ओलिगोस hU6 प्रमोटर के बहाव PXL क्लोनिंग वेक्टर में डाला जाता है और BbsI क्लोनिंग साइटों का उपयोग कर एक गाइड आरएनए पाड़ के नीचे की ओर जाता है (चित्रा 1, चरण 1)। इस sgRNA तो PXL से excised और BstBI और Paci साइटों (चित्रा 1, चरण 2) का उपयोग कर pRubi रीढ़ की हड्डी में डाला जाता है। अंत में, एक और sgRNA PXL में क्लोन pRubi-Guide1 (चित्रा 1, चरण 3) में पहली गाइड के बहाव रखा जा सकता है, जीन के एक अन्य क्षेत्र को लक्षित और NHEJ के माध्यम से एक पीटकर की संभावना बढ़ रही है। सही निर्माणों का सत्यापन अनुक्रम विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। एक बार जब इस निर्माण किया जाता है, यह एक वायरस के लिए &quot;रेट्रो / Lentiviral उत्पादन के CaPO4 विधि के लिए प्रोटोकॉल&quot; में पैक किया जा सकता है। सफल पैकेजिंग आदेश वी अनुमापांक करने में HEK293 कोशिकाओं में वायरस के संक्रमण की पुष्टि की हैirus। अगर कोई fluorophore अभिव्यक्ति है तो वहाँ की संभावना वायरस की पैकेजिंग के दौरान एक त्रुटि थी। चित्रा 2 2 रेट्रोवायरस, एक व्यक्त GFP और अन्य व्यक्त mCherry के एक प्रतिनिधि परिणाम है, नवजात माउस (7 दिन पुराना) की दांतेदार गाइरस में सह इंजेक्शन और 21 दिन imaged के बाद इंजेक्शन। mCherry या GFP के साथ न्यूरॉन्स की लेबलिंग केवल एक fluorophore व्यक्त की अनुमति देता है एक ही ऊतक में विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़, जहां एक वायरस एक CRISPR व्यक्त कर सकते हैं की रूपात्मक आकलन / Cas9 मध्यस्थता KO और अन्य एक नियंत्रण वायरस। Stereotaxic इंजेक्शन सटीक संरचनात्मक चयनात्मकता के रूप में करना निर्देशांक, दांतेदार गाइरस के असतत संक्रमण द्वारा प्रदर्शन की अनुमति देता है। जब संक्रमण के लिए मस्तिष्क वर्गों का विश्लेषण, यह आसपास के ऊतकों को रखने के लिए जब तक यह निर्धारित किया जाता है कि सही संरचनात्मक क्षेत्र संक्रमित किया गया था महत्वपूर्ण है। अगर वहाँ संक्रमण के कोई संकेत नहीं है, तो यह संभव है कि इंजेक्शन के एक पड़ोसी क्षेत्र एक में हुईडी आसपास के वर्गों में पहचाना जा सकता है। यह भी सटीक इंजेक्शन लगाने के लिए क्षेत्र सुई ट्रैक का पता लगाने में सहायक हो सकता है। VSVG छद्म वायरस शायद ही कभी के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 3) द्वारा विश्लेषण किया है, जब विवो में इंजेक्शन, और पूरे दांतेदार गाइरस साथ व्याख्यान चबूतरे / दुम अक्ष संक्रमित कोशिकाओं के साथ फैल जाते हैं दांतेदार गाइरस के हाशिये से बाहर फैल गया। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> चित्रा 1:। रेट्रोवायरल pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR प्लाज्मिड के लिए क्लोनिंग रणनीति इस रणनीति फू-आधारित lentiviral प्लास्मिड के लिए समान है। sgRNA ओलिगोस annealed और BSBI क्लोनिंग साइटों का उपयोग कर PXL में डाला जाता है। अनुक्रमण सुनिश्चित करने के बाद कि sgRNA सफलतापूर्वक PXL में डाला जाता है, BstBI और Paci साथ प्लाज्मिड को पचाने। डालें कि (ब्लैक बॉक्स) बाहर गिरा दिया जाता है तो वायरल वापस ख में क्लोन हैएक काले (बिंदीदार रेखा) pRubi-Guide1 CRISPR। एक दूसरा sgRNA भी PXL में डाला जा सकता है और Paci एंजाइम का उपयोग कर बाहर पच। यह तो pRubi-Guide1 CRISPR वेक्टर (लाल बिंदीदार रेखा) Paci साइट का उपयोग में क्लोन है। परिणामी प्लाज्मिड तो गाइड किस्में दोनों के साथ ही आवश्यक वायरल तत्व, प्रमोटरों, और fluorophores होता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> चित्रा 2:। माउस दांतेदार गाइरस के रेट्रोवायरल इंजेक्शन रेट्रोवायरस mCherry (लाल) या GFP (हरा) को व्यक्त करने के लिए एक P7 माउस के दांतेदार गाइरस में इंजेक्ट किया गया। 21 दिन बाद चूहों perfused थे और दिमाग sectioned और GFP और mCherry के लिए दाग। (ए) एक 5x व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट छवि जनसंपर्क चलतादांतेदार गाइरस इंजेक्शन की ecision और लेबलिंग दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की विशिष्टता। हिप्पोकैम्पस की आकृति विज्ञान DAPI (नीला) धुंधला के माध्यम से देखा जा सकता है। स्केल बार 200 माइक्रोन के उपाय। (बी) के एक 10x व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट छवि को दर्शाता है कि इन उच्च अनुमापांक lentiviruses कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है जिसकी आकृति विज्ञान fluorophore अभिव्यक्ति के माध्यम से पहुँचा जा सकता है संक्रमित। स्केल बार 100 माइक्रोन के उपाय। (सी) वायरस GFP या mCherry व्यक्त दांतेदार गाइरस में सह इंजेक्शन थे। रेट्रोवायरस की एक प्रणाली का उपयोग करते हुए, एक के बाद एक आनुवंशिक हेरफेर GFP और एक अन्य हेरफेर mCherry द्वारा चिह्नित द्वारा चिह्नित करने के लिए एक वायरस का उपयोग कर सकते हैं, और फिर एक वायरस के कारण एक या additive परिवर्तन का आकलन करें। स्केल बार 10 माइक्रोन के उपाय। <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> चित्रा 3:। Lentiviral इंजेक्शन के संरचनात्मक प्रसार Stereotaxic coinjection<html> एक GFP-shPten वायरस और एक वयस्क के मस्तिष्क में एक mCherry नियंत्रण वायरस के PTEN loxP / + माउस पूरे व्याख्यान चबूतरे / हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस की दुम अक्ष के साथ एक वायरल प्रसार में हुई। इस इंजेक्शन के लिए किस हद तक में बंद कर दिया वायरल प्रसार की आकृति 21 धारावाहिक वर्गों (जेड = 50 माइक्रोन / अनुभाग) पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने पर पता लगाया गया की एक 3 डी पुनर्निर्माण में दिखाया गया है। समोच्च ट्रेसिंग तो मात्रा मात्रा का ठहराव के लिए 3 डी छवियों को उत्पन्न करने के लिए गठबंधन किया गया। कुल वायरल प्रसार हरे रंग में दिखाया गया है (मात्रा = 54730800 माइक्रोन 3) और दांतेदार स्थानीय प्रसार बैंगनी रंग में दिखाया गया है (मात्रा = 27275200 माइक्रोन 3)। वायरस सुई ट्रैक और दांतेदार गाइरस के व्याख्यान चबूतरे / दुम अक्ष भरने के अलावा सुई ट्रैक के चौराहे पर महासंयोजिका साथ फैलता है। स्केल बार 200 माइक्रोन के उपाय। लेस / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; पूरक 1 वीडियो sgRNAs के डिजाइन रेट्रोवायरल और lentiviral रीढ़ की हड्डी में क्लोन करने के लिए। इस कृत्रिम गाइड आरएनए (sgRNA) डिजाइन उदाहरण में, माउस CHD8 के जीनोमिक अनुक्रम एन सी बी आई से डाउनलोड किया जाता है। प्रारंभ कोडोन और एक्सॉन संरचना तो वेक्टर एनटीआई में कल्पना कर रहे हैं। यह हमें पहले कोडिंग एक्सॉन के आसपास जीनोमिक क्षेत्र कॉपी और Benchling में इस क्रम में प्रवेश करने की अनुमति देता है। Benchling हमें इस क्षेत्र में सभी संभावित sgRNAs कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम जीनोमिक क्षेत्र इनपुट का संकेत के बाद, Benchling हमें प्रत्येक गाइड शाही सेना के लिए ऑन-लक्ष्य और बंद लक्ष्य स्कोर दिखाएगा। उपयोगकर्ता तो उच्चतम राशि पर और बंद लक्ष्य स्कोर के साथ गाइड आरएनए का चयन कर सकते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

डिजाइनिंग, पैकेजिंग, और stereotaxic इंजेक्शन के माध्यम से उच्च अनुमापांक CRISPR रेट्रो और lentiviruses की डिलिवरी

CRISPR / Cas9 प्रणाली संभावित सुलभ और वैज्ञानिक समुदाय के लिए सस्ती लक्षित जीनोम का संपादन करता है। इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के वायरस है कि CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग कर ब्याज की एक जीन पीटा जाएगा, और फिर उन्हें वयस्क माउस मस्तिष्क में stereotaxically इंजेक्षन बनाने के लिए कैसे करना है।

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

प्लाज्मिड गैर निलय इंजेक्शन और electroporation द्वारा जीन प्रसवोत्तर चूहा मस्तिष्क के लिए डिलिवरी

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

कृंतक Stereotaxic और व्यवहार Neuroscience के लिए सर्जरी पशु कल्याण परिणाम सुधार

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के द्वारा विस्तार<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation या वायरल Stereotaxic इंजेक्शन

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

माउस स्पाइनल कॉर्ड में सशर्त हेरफेर जीन के लिए एक वायरल वेक्टर की Stereotaxic इंजेक्शन

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

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We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

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Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

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Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

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Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन के माध्यम से लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं संशोधन का शामिल

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...