Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal NINH concedere R01MH097949 e l&#39;autismo parla pilota di Grant 7359 al BWL e il Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Shared Strumentazione di Grant P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono alcuni passaggi critici che sono importanti per il confezionamento virale di successo. salute delle cellule è critico prima e durante la trasfezione, le cellule non sane ridurrà notevolmente la quantità di virus prodotto. Se la trasfezione e confezionamento hanno successo, allora il 100% delle cellule dovrebbe esprimere il fluoroforo e le celle deve formare un sincizio funzionale. Nel passaggio 3.2.4, toccando il tubo è necessaria per alto titolo trasfezione efficiente, e il pH della soluzione salina tamponata con HEPES-deve essere esatta. Il maxi-prep che producono i plasmidi necessari per il confezionamento virale devono essere estremamente puro. A questo punto, è utile etanolo precipitare il DNA eluizione finale e risospendere in tampone Tris-EDTA. È inoltre molto importante per ridurre la quantità di siero a 2% o meno nei media che la caffeina è aggiunta a il giorno 6 (passo 3.4) prima della raccolta virale. Se il siero non viene ridotta, quindi il virus purificato finale contiene una quantità indesiderabile di prot sieroEin. L&#39;uso di polietilene glicole 6000 quando precipitare le particelle virali esclude la necessità di ultracentrifugazione. E &#39;anche importante notare che i CRISPR contenente virus Cas9 tipicamente hanno un titolo circa 10 volte inferiore a virus contenenti esclusivamente un fluoroforo. Per la radiochirurgia stereotassica, l&#39;uso di anestesia inalatoria permette un controllo rapido e preciso o coscienza dell&#39;animale rispetto agli anestetici iniettabili e permette anestesia su una gamma di età maggiore. E &#39;molto importante mantenere gli strumenti chirurgici pulito e sterile, e il targeting riproducibile richiede un posizionamento preciso della testa. Assicurarsi che non vi è alcuna beccheggio o di rollio della testa nello strumento stereotassico e che il cranio si sente saldamente in posizione. Può essere utile per consentire il cranio asciugare per trovare i punti di sutura per determinare le coordinate stereotassica. Inoltre, il tasso e il volume per ogni stereotassica coordinate dovrebbero essere empiricamente determinato. Questa tecnica è limitante in quanto la diffusione di un lenti- o di retrovirus è limitato, soprattutto se confrontato con i virus adeno-associati (AAV) .Pertanto, questi virus sono utili quando infettare una regione del cervello discreta, ma non per l&#39;infezione complessivo associato con AAV utilizzato per l&#39;analisi del comportamento in animali. L&#39;uso di caffeina in questo protocollo aumenta notevolmente il titolo di questi virus, ma non sono ancora alto come i titoli ottenuti in imballaggi AAV. Inoltre, l&#39;integrazione stabile è solo un vantaggio di espressione fluoroforo, come forma CRISPR / Cas9 stabili modifiche genomiche anche quando transientemente trasfettate ed è possibile che in corso espressione del Cas9 e sgRNA possono eventualmente produrre effetti fuori bersaglio. L&#39;espressione transiente del sistema / Cas9 CRISPR con AAV è sufficiente a produrre cambiamenti genomici che si propagano per tutta divisioni cellulari, tuttavia, espressione fluoroforo non venga mantenuta. Creazione di lenbrano e retrovirus che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 impartirà la possibilità di indirizzare qualsiasi nuova gene in un&#39;ampia varietà di organismi. L&#39;efficienza di editing gene sembra essere dipendente dalla sequenza del RNA guida mira la scissione Cas9. È stato determinato empiricamente che tra il 10% e il 80% dei cloni contengono indels dopo sequenziamento infettato cellule Neuro2A. E &#39;attualmente noto se le frequenze INDEL calcolati in cellule Neuro2A sono riflettenti di quelle in neuroni. Guida al software di progettazione RNA come Benchling ora includono un punteggio &quot;on-target&quot;, che può essere in grado di predire l&#39;efficacia di una data sequenza bersaglio. Fino a che punto tali punteggi &quot;a bersaglio&quot; sono bisogni affidabili da determinare empiricamente nei neuroni e altri tipi di cellule, come il sistema di CRISPR-Cas9 diventa più ampiamente attuate. produzione animale transgenico lentivirus-based è stato variamente successo con i rapporti che i transgeni lentivirus-consegnato diventano SIricevitore in presenza 11. CRISPR editing gene mediata del DNA può essere passato attraverso la linea germinale per generare modelli animali interi. Così, stabile l&#39;editing genomico può essere realizzabile, nonostante il silenziamento di fluorofori virali-consegnato e transgeni Cas9. Questo può fornire una piattaforma efficiente per alterazioni genomiche mirati. La consegna virale del sistema / Cas9 CRISPR, pur non richiedendo organismi transgenici, è complementare a quelle tecniche. Ad esempio, l&#39;iniezione di tali particelle virali in un animale transgenico composto che esprime inducibile Cre e Cre opto dipendente o chimico-genetico transgeni dovrebbe facilitare studi complessi sul rapporto tra manipolazioni genetiche e attività neuronale. Un secondo esempio è quello di fornire queste particelle virali Cas9 / sgRNA in un knockout condizionale, nel tentativo di screening per le interazioni gene-gene. Infine, un altro itinerario interessante di questa ricerca è lo screening di fenotipi e composti terapeutici nelle cellule del paziente derivata, che puòessere utilizzato per convalidare e scoprire le reti genetiche che sono interrotti in varie malattie.

Per studiare la base della normale fisiologia e patologia malattia, vi è la necessità di manipolare con precisione l&#39;espressione genica in organismi modello. Per organismi modello mammiferi, questo è in gran parte incentrata sulla creazione e lo sviluppo di topi transgenici in cui un elemento genetico di interesse è affiancato da siti riconosciuti da un ricombinasi. Ciò può risultare in una determinata manipolazione sito di questi geni affiancate. Anche se questa è stata una strategia di successo, è tempo e risorse; per esempio, la creazione di un animale transgenico tripla che esprimesse un gene floxed, Cre ricombinasi, e un gene reporter Cre richiede più accoppiamenti e convalida. Al contrario, l&#39;iniezione stereotassica di replicazione particelle virali difettose codificano una proteina fluorescente e la ricombinasi in un gene animale floxed non necessita genotipizzazione complesse o strategie di selezione 1. Inoltre, se una proteina fluorescente e Cre esprimere virus è co-iniettata con una seconda Enco virusding una proteina fluorescente diversa, allora questo fornisce un controllo all&#39;interno dei tessuti per la manipolazione genetica mirata. Mentre questa strategia richiede ancora l&#39;uso di animali knock-in, strategie di RNA virale basato mediate aggirare la necessità di animali transgenici. Ad esempio, l&#39;iniezione stereotassica di virus replica-carenza che codificano una proteina fluorescente e un RNA breve hairpin (shRNA) può utilizzare macchinari endogena RNAi della cellula comportare una riduzione potenti della trascrizione di un gene di interesse. Tuttavia, le strategie shRNA producono sottile gene knock-down, spesso con conseguente modesti fenotipi cellulari 2. Mentre un knock-down può essere più fisiologicamente rilevanti per la disfunzione del gene eterozigote, la sua diminuzione robustezza rispetto ad un knock-out non è l&#39;ideale per la scoperta di nuovi geni fenotipica. Una terza tecnica che si è recentemente emerso, il CRISPR (cluster regolarmente intervallate Ripetere palindromo Short) / Cas9 (CRISPR-associataproteine ​​9) del sistema, si basa sulla espressione sia un piccolo RNA esogeno e un enzima taglio DNA. Il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato dal sistema immunitario procariote che si è evoluto un metodo per identificare estera, invadendo il DNA di virus e il targeting per la degradazione mediante l&#39;enzima Cas9 3,4. Questa potente tecnica di montaggio del genoma può essere utilizzato per la creazione di eliminazioni mirate, inserimenti, e mutazioni; e il seguente protocollo illustrerà come fare delezioni in un gene di interesse per knockout sua espressione in vivo. L&#39;enzima Cas9 deve essere espresso con un RNA guida omologa alla regione di interesse e contigua con un RNA ponteggio. Knockout di un gene utilizzando questa tecnica richiede mira Cas9 ad una regione specifica del genoma utilizzando RNA guida sintetici (sgRNA), e inducendo rotture a doppio filamento (DSB) in un sito di interesse. Questi DSB sono poi riparati dal macchinario cellulare di riparazione endogena via non omologa end-joining (NHEJ), che leannuncio a indels che possono produrre missenso o nonsense mutazioni e può quindi costituire una perdita di espressione della proteina funzionale 5. Poiché questo sistema produce alterazioni genomiche, richiede solo l&#39;espressione transiente del Cas9 e sgRNA. Tuttavia, è desiderabile che un indicatore fluorescente stabile per identificare le cellule e la loro progenie manipolati in questo modo. Lenti- e retrovirus hanno il vantaggio di stabile integrazione del DNA di interesse nelle cellule ospiti che mantengono l&#39;espressione a lungo termine e si tramandano alle cellule figlie durante la mitosi. Questo protocollo descrive la progettazione e realizzazione di due tipi di replica difettoso, retrovirus alto titolo: il virus dell&#39;immunodeficienza umana derivati ​​particelle lentivirali (lentivirus) e quelli basati su murino virus Maloney leucemia (retrovirus). Mentre entrambi di questi virus sono in grado di supportare esprimere stabile di grandi transgeni, le particelle retrovirali possono integrare solo nel genoma dudivisione cellulare anello con la degradazione della membrana nucleare, e quindi può essere utilizzata come strumento per etichettare e cellule data di nascita 6. Mentre lentivirus hanno la reputazione di essere relativamente basso titolo 7, questa metodologia, compreso l&#39;uso di caffeina durante la raccolta 8 virale, produce abitualmente titoli di 10 9 e 10 10 particelle / ml. Un altro vantaggio di lenti- e retrovirus è la tolleranza per grandi inserti. Il seguente insieme di protocolli delinea la procedura per la progettazione di un lenti o di retrovirus che codifica per un reporter fluorescente, sgRNAs, e Cas9 di utilizzare il sistema / Cas9 CRISPR di modificare il DNA, così come esprimere una proteina fluorescente. Mouse neurochirurgia stereotassica è un metodo valido per l&#39;iniezione di virus in vivo per studiare la morfologia, la funzione e la connettività dei neuroni infetti. L&#39;infezione virale nei neuroni può essere usato per manipolare i livelli di espressione per un periodo prolungato di time, ad esempio durante lo sviluppo, e l&#39;espressione possono essere controllati con precisione mediante l&#39;uso di vari sistemi inducibili farmacologici e espressione specifica guidato Cre. Questo protocollo particolare spiega come iniettare un virus che esprime un sgRNA e Cas9 per knockout un gene di interesse nel cervello di un topo adulto. Topi recuperare molto rapidamente da questa procedura e espressione del transgene virale può essere visto entro 48 ore dopo l&#39;iniezione. Tuttavia, l&#39;espressione fluoroforo sembra aumentare nel corso di settimane conseguenti livelli massimi vicino da 3 settimane dopo l&#39;infezione. I topi che subiscono l&#39;iniezione stereotassica virale possono essere utilizzati per il comportamento, elettrofisiologia, o studi morfologici. Nel complesso, lo scopo di queste procedure è quello di dimostrare come knockout un gene nel cervello di topo adulto con radiochirurgia stereotassica e un virus che esprime un sgRNA specifico e Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
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			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
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			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

A seguito del &quot;Protocollo per la progettazione di una guida Strand (sgRNA) per CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, oligo di targeting una particolare sequenza vengono inseriti nel PXL clonazione vettore valle del promotore hU6 ea valle di un ponteggio guida RNA utilizzando i siti di clonazione BBSI (Figura 1, punto 1). Questo sgRNA viene poi asportato da PXL e inserito nella spina dorsale pRubi utilizzando i siti BstBI e Paci (Figura 1, punto 2). Infine, un&#39;altra sgRNA clonato in PXL può essere posizionato a valle della prima guida in pRubi-Guide1 (Figura 1, fase 3), il targeting un&#39;altra zona del gene e aumentando le possibilità di un knockout via NHEJ. Verifica dei costrutti corretti dovrebbe essere determinata mediante analisi di sequenza. Una volta che questo costrutto è fatto, può essere confezionato in un virus a seguito del &quot;Protocollo per il Retro / lentivirali Produzione- CaPO4 Method&quot;. confezionamento di successo è confermata da infezione da virus in cellule HEK293 per poi titolare la vIRU. Se non vi è alcuna espressione fluoroforo allora è probabile un errore durante il confezionamento del virus. La figura 2 è un risultato rappresentativo di 2 retrovirus, una GFP esprimere e l&#39;altra esprimere mCherry, co-iniettato nel giro dentato topo neonatale (7 giorni di età) e ripreso 21 giorni dopo l&#39;iniezione. Etichettatura di neuroni con mCherry o GFP permette la valutazione morfologica delle varie manipolazioni genetiche in uno stesso tessuto, in cui un virus può esprimere un CRISPR / Cas9 mediata KO e l&#39;altro un virus di controllo, che esprime esclusivamente un fluoroforo. iniezione stereotassica consente precisa selettività anatomica come dimostra l&#39;infezione discreta delle coordinate destinate, giro dentato. Quando si analizzano le sezioni di cervello per l&#39;infezione, è importante mantenere i tessuti circostanti fino a quando non è stato accertato che la regione anatomica corretta è stato infettato. Se non vi è alcun segno di infezione, allora è possibile che l&#39;iniezione avvenuta in una regione di una vicinad può essere identificato nelle sezioni circostanti. Può anche essere utile per individuare il percorso dell&#39;ago per trovare la regione di iniezione esatto. VSVG virus pseudotyped raramente sparsi dei margini del giro dentato quando iniettato in vivo, e tendono a diffondersi lungo le cellule asse infettare rostrali / caudale lungo tutto il giro dentato, come analizzato da ricostruzione 3D (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Clonazione strategia per il plasmide pRubi-Guide1-Guide2-retrovirale CRISPR Questa strategia è identica per i plasmidi lentivirali FU-based. oligo sgRNA sono ricotto e inseriti in PXL utilizzando i siti di clonazione BSBI. Dopo il sequenziamento per garantire che il sgRNA è inserita con successo in PXL, digerire il plasmide con BstBI e Paci. L&#39;inserto che viene abbandonato (scatola nera) viene poi clonato nel virale posteriore buno (il nero linee tratteggiate) pRubi-Guide1 CRISPR. Una seconda sgRNA può essere inserito anche in PXL e digerito utilizzando l&#39;enzima PACI. Questo viene poi clonato nel vettore CRISPR pRubi-Guide1 (rosse linee tratteggiate) utilizzando il sito PACI. Il plasmide risultante contiene quindi entrambi i filamenti di guida, nonché gli elementi virali necessari, promotori, e fluorofori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. Iniezione retrovirale del giro dentato del mouse retrovirus che esprimono mCherry (rosso) o GFP (verde) sono stati iniettati nel giro dentato di un mouse p7. 21 giorni dopo, i topi sono stati perfusi e il cervello sezionati e colorati per la GFP e mCherry. (A) Un immagine fluorescente a grande campo 5X mostra la prECISIONE dell&#39;iniezione giro dentato e la specificità di etichettatura dentate neuroni granulari giro. La morfologia dell&#39;ippocampo può essere visto attraverso la (blu) colorazione Dapi. barra della scala misura 200 micron. (B) L&#39;immagine fluorescente 10 volte più grande campo dimostra che questi lentivirus alto titolo infettare un gran numero di cellule la cui morfologia è possibile accedere tramite espressione fluoroforo. barra della scala misura 100 micron. (C) I virus che esprimono GFP o mCherry sono stati co-iniettate in giro dentato. Utilizzando un sistema di retrovirus, si può usare un virus per effettuare una manipolazione genetica segnata da GFP e un&#39;altra manipolazione segnata da mCherry e quindi valutare le variazioni singole o additivi a causa di ogni virus. barra della scala misura 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Diffusione anatomica di iniezione lentivirali coiniezione Stereotassica<html> di un virus GFP-shPten e un virus di controllo mCherry nel cervello di un adulto Pten loxP / + topo ha provocato una diffusione virale lungo tutta la rostrale / asse caudale del giro dentato dell&#39;ippocampo. Questo è mostrato in una ricostruzione 3D della portata di iniezione in cui chiusi contorni della diffusione virale sono stati rintracciati oltre 21 sezioni seriali (Z = 50 um / sezione) utilizzando software di ricostruzione. I tracciati di contorno sono poi stati allineati per generare le immagini 3D per il volume quantificazione. Diffusione virale totale viene visualizzato in verde (volume = 54.730.800 micron 3) e la diffusione dentato-localizzato è mostrato in viola (volume = 27.275.200 micron 3). Il virus si diffonde lungo il percorso dell&#39;ago e il corpo calloso all&#39;intersezione della traccia dell&#39;ago oltre al riempimento all&#39;asse rostrale / caudale del giro dentato. barra della scala misura 200 micron. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Supplemental Video 1. Progettazione di sgRNAs per clonare in backbone retrovirali e lentivirali. In questo esempio di progettazione guida sintetica RNA (sgRNA), la sequenza genomica di CHD8 mouse viene scaricato da NCBI. Il codone di inizio e la struttura esone vengono poi visualizzati in Vector NTI. Questo ci permette di copiare la regione genomica intorno al primo esone codifica ed entriamo in questa sequenza Benchling. Benchling ci permette di visualizzare tutti i potenziali sgRNAs nella regione. Inoltre, dopo che indica la regione genomica che abbiamo in ingresso, Benchling ci mostrerà i punteggi on-target e off-bersaglio per ogni RNA guida. L&#39;utente può quindi selezionare l&#39;RNA guida con i punteggi più alti in bilancio e fuori bersaglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l&#39;editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

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