Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
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이 작품은 R01MH097949을 부여 NINH에서 지원하고, 자폐증은 BWL와 노리스 코튼 암 센터의 광학 이미징 공유 계측 그랜트 P30CA023108에 파일럿 그랜트 7359을 말한다.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

성공적인 바이러스 성 포장에 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 비정상 세포가 크게 발생 바이러스의 양을 감소하므로 셀 상태는 이전과 트랜시 중요하다. 형질 포장이 성공적이라면, 셀의 100 %가 형광을 표현해야하고, 세포는 기능 syncytium을 형성한다. 단계 3.2.4 튜브를 탭하면 효율적 고역가 형질 전환에 필요하고, HEPES 완충 생리 식염수의 pH가 정확해야한다. 바이러스 성 포장에 필요한 플라스미드를 생산하는 맥시 준비합니다 매우 순수해야합니다. 이 점, 상기 최종 용출 DNA를 침전시키고 에탄올 트리스 EDTA 버퍼에 일시 중지 다시 유용하다. 이는 카페인이 바이러스 컬렉션 전날 6 (스텝 3.4)에 첨가되어있는 배지에서 2 % 이하로하는 혈청의 양을 줄이기 위해 매우 중요하다. 혈청이 감소되지 않은 경우, 최종 정제 된 바이러스 혈청 PROT의 바람직하지 않은 양을 포함EIN. 폴리에틸렌 글리콜 바이러스 입자를 침전 6000의 사용은 초 원심 분리의 필요성을 제외한다. Cas9의 CRISPR 포함 된 바이러스는 일반적으로 단독으로 형광을 포함하는 바이러스보다 배 이하 (10) 주변의 역가를 참고하는 것도 중요합니다. 정위 수술 흡입 마취제의 사용은 주 사용 마취제에 비해 신속하고 정확한 제어 또는 동물의 의식을 허용하고 큰 연령대 통해 마취를 허용한다. 깨끗하고 무균 수술 악기를 유지하는 것이 매우 중요하며, 재생 가능한 타겟팅은 머리의 정확한 위치를 필요로한다. 정위 악기와 두개골이 제자리에 단단히 느낌이 머리의 어떤 피칭 또는 롤링이없는 것을 확인합니다. 또한 두개골의 정위 좌표를 결정하는 봉합사를 찾기 위해 건조되도록하는 것이 유용 할 수있다. 또한, 정위 좌표 각각에 대해 레이트 및 부피는 경험적으로 결정되어야한다. 이 기술은 (AAVs) .Therefore 아데노 - 관련 바이러스에 비해 때 렌티 또는 레트로 바이러스의 확산이 특히 제한되는 이산 뇌 영역에 감염 될 때, 이러한 바이러스는 가치가 있지만, 전체 감염 AAVs과 연관되지 않은 것을 제한하고 동물 행동 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜 카페인의 사용은 크게 이러한 바이러스의 역가를 증가 시키지만 여전히 AAV 포장에서 얻어지는 적정량만큼 높지 않다. 또한, 일시적으로 형질 때 CRISPR / Cas9 안정 게놈 편집도 형성으로 안정적인 통합 형광 발현의 장점이 있고이 가능하다 진행중인 결국 목표 효과를 생성 할 수있다 Cas9 및 sgRNA의 발현을. AAVs와 CRISPR / Cas9 시스템은 세포 분열에 전파되는 게놈 변화를 생성하기에 충분한 과도 발현은, 그러나, 형광 발현이 유지되지 않을 것이다. 렌의 창조ti- 및 CRISPR / Cas9 체계를 이용하여 레트로 바이러스는 다양한 유기체의 모든 신규 유전자를 타겟팅하는 능력을 부여한다. 유전자 편집의 효율 Cas9 절단 타겟팅 가이드 RNA의 순서에 의존 할 것으로 보인다. 경험적으로 시퀀싱 Neuro2A 세포를 감염 후 10 % 내지 클론의 80 %가 삽입과 삭제를 포함하는 것으로 결정되었다. Neuro2A 세포에서 산출 INDEL 주파수 뉴런에서 그들의 반사 여부 현재 알려져 있지 않다. 이러한 Benchling 같은 안내 RNA 디자인 소프트웨어는 주어진 표적 서열의 효율을 예측할 수있다 「온 대상 &quot;점수를 포함한다. 예 : &quot;온 대상&quot;점수가 더 광범위하게 구현된다 경험적으로 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 신경 세포와 다른 세포 유형으로 결정되는 신뢰할 수있는 요구에 어떤 정도. 렌티 바이러스 기반의 형질 전환 동물 생산은 렌티 바이러스-전달 유전자는 경기도가 있다는 보고서를 가변적으로 성공했다11 lenced. DNA의 CRISPR 매개 유전자 편집 전체 동물 모델을 생성하기 위해 세균 라인을 통해 전달 될 수있다. 따라서, 안정적인 게놈 편집 바이러스-전달 형광체 및 Cas9의 유전자의 침묵에도 불구하고 달성 할 수있다. 이 대상으로 게놈 변경에 대한 효율적인 플랫폼을 제공 할 수있다. CRISPR / Cas9 시스템의 바이러스 전달, 트랜스 제닉 생물을 요구하지 않는 반면, 이들 기술들에 상보 적이다. 예를 들어, inducibly 유전자 조작과 신경 활동 사이의 관계에 복잡한 연구를 촉진한다 Cre 호텔과 Cre 호텔 의존 opto- 또는 화학 - 유전 형질 전환 유전자를 발현하는 화합물 형질 전환 동물에 이러한 바이러스 입자를 주입. 두 번째 예는 유전자 - 유전자 상호 작용을 선별하기위한 시도 조건부 녹아웃에이 Cas9 / sgRNA 바이러스 입자를 제공하는 것입니다. 마지막으로,이 연구의 또 다른 흥미로운 경로는 환자 유래 세포의 표현형 및 치료 화합물의 선별,하는 수이다확인하고 다양한 질환 파쇄 유전자 네트워크를 탐색하는데 사용될 수.

정상적인 생리 질환 병리의 기초 연구를 정밀 모델 유기체에서 유전자 발현을 조작 할 필요가있다. 관심있는 유전 요소는 재조합 효소 인식 부위와 측면으로 접하고, 상기 포유 동물 모형 유기체이 크게 제작 및 형질 전환 마우스의 개발에 집중되어있다. 이것은 이러한 측면 유전자의 사이트 특정 조작 될 수 있습니다. 이 성공적인 전략되었지만, 시간 및 리소스 집약적이고; 예를 들어, floxed 유전자 Cre 호텔의 재조합 효소 및 Cre 호텔 리포터 유전자를 발현 것 트리플 형질 전환 동물을 만드는 것은 여러 교배 및 검증을 필요로한다. 대조적으로, 복제의 정위 주사는 floxed 유전자 동물에 형광 단백질 및 재조합 효소를 코딩하는 결함 바이러스 입자는 복합 유전형 또는 사육 한 전략을 필요로하지 않는다. 바이러스 발현 형광 단백질 및 Cre 호텔 경우 또한, 제 ENCO 바이러스와 공동 주입딩 다​​른 형광 단백질, 이것은 표적 유전자 조작을위한 내부 - 조직 제어를 제공한다. 이 전략은 여전히​​ 녹아웃 동물의 사용을 필요로하지만, 급속도로 매개되는 RNA 기반 전략은 형질 전환 동물에 대한 필요성을 회피. 예를 들어, 형광 단백질과 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를)를 인코딩 복제 결핍 바이러스의 정위 주사는 관심의 유전자의 전사의 강력한 감소가 발생하는 세포의 내생의 RNAi 기계를 사용할 수 있습니다. 그러나, shRNA를 전략은 종종 겸손 세포의 표현형이 발생 미묘한 유전자 노크 다운을 생산하고 있습니다. 노크 다운 더 생리 학적 이형 유전자 장애에 대한 관련 될 수 있지만, 그 감소 견고성이 노크 아웃에 비해이 새로운 유전자의 표현형 발견에 적합하지 않습니다. 최근에 등장했습니다 세 번째 기술 관련 CRISPR-(정기적으로 Interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 클러스터)를 CRISPR / Cas9은 (단백질 9) 시스템은, 작은 외래 RNA 및 DNA 절단 효소의 발현 양에 의존한다. CRISPR / Cas9 시스템은 외국 식별 바이러스로부터 DNA를 침입하고 Cas9 효소 3,4를 통해 열화를 대상으로하는 방법을 진화 원핵 면역 시스템에서 적응했다. 이 강력한 게놈 편집 기술은 표적 결실, 삽입 및 돌연변이를 만드는 데 사용될 수있다; 다음과 같은 프로토콜은 생체 내에서 발현을 녹아웃하기 위해 관심의 유전자에 삭제를하는 방법을 간략하게 설명합니다. Cas9 효소는 발판 RNA와 관심 영역에 상동과 인접 가이드 RNA로 표현해야합니다. 이 기술을 이용하여 유전자의 녹아웃 합성 RNA를 가이드 (sgRNA)를 사용하여 게놈의 특정 영역에 Cas9 타겟팅 및 관심 부위에서 이중 가닥 나누기 (DSBs)을 유발 요구한다. 이 DSBs 후 비 동종 최종 합류 (NHEJ)하는 제작을 통해 내생 세포 수리 기계 수리된다과오 또는 넌센스 돌연변이를 생성 할 수 있으므로 기능성 단백질 식 (5)의 손실을 만들 수 있습니다 삽입과 삭제에 광고. 본 시스템은 게놈 변경을 생성하기 때문에, 단지 Cas9 및 sgRNA의 일시적인 발현을 필요로한다. 안정 형광 표시기가 이와 같이 조작 된 세포 및 그 자손을 식별하기 위해 그러나 바람직하다. 레트로 바이러스 및 렌티 안정적으로 장기간의 발현 및 유사 분열 동안 유지 딸세포까지 전달되는 숙주 세포에 관심 DNA를 통합하는 이점을 갖는다. 이 프로토콜 설계 및 결함 복제 고역가 레트로 바이러스의 두 종류의 생산을 설명 인간 면역 결핍 바이러스 유래의 렌티 바이러스 입자 (렌티)과 말로 뮤린 백혈병 바이러스 (레트로 바이러스)에 기초하여 이들. 이러한 바이러스의 양이 안정한 큰 유전자의 발현을 지원할 수 있지만, 레트로 바이러스 입자는 게놈 내로 통합 할 수 뒤따라서 핵 봉투의 저하와 함께 반지 세포 분열은 레이블을 도구 및 출생 날짜 셀 (6)로 사용할 수 있습니다. 렌티 바이러스는 바이러스를 수집하는 동안 카페인 (8)의 사용을 포함하여 상대적으로 낮은 역가 7,이 방법론 인 명성을 가지고 있지만, 통상적으로 10 9 10 10 입자 / ml의의 역가를 생성합니다. 렌티 및 레트로 바이러스의 또 다른 이점은 매우 큰 인서트에 대한 내성이다. 다음 프로토콜 모음 형광 리포터는 sgRNAs 및 Cas9은 DNA를 변경뿐만 아니라 형광 단백질을 발현하는 CRISPR / Cas9 시스템을 이용하는 코딩하는 렌티을 설계 또는 레트로 바이러스에 대한 절차를 설명. 마우스 정위 신경 외과는 형태, 기능, 감염된 신경 세포의 연결을 연구하기 위해 생체 내에서 바이러스를 주입하기위한 유용한 방법이다. 신경 세포의 바이러스 감염이 팀 장기간에 걸쳐 발현을 조작하기 위해 사용될 수있다이러한 개발에 걸쳐 같은 즉, 표현은 정확하게 다양한 약물 유도 시스템 및 특정 Cre 호텔 구동 식의 사용에 의해 제어 될 수있다. 이 특정 프로토콜은 성인 쥐의 뇌에 대한 관심의 유전자를 녹아웃하는 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 주입하는 방법에 대해 설명합니다. 마우스는 48 시간 후 분사 내에서 볼 수있는 바이러스 성 유전자의 절차와 표현에서 매우 신속하게 복구 할 수 있습니다. 그러나, 형광 발현 3 주 후 감염에 의해 근처 최대 수준의 결과 주간의 과정을 통해 증가가 나타납니다. 바이러스 정위 주사를 거쳐 마우스 동작, 전기 생리학 또는 형태 학적 연구에 사용할 수있다. 전반적으로, 이러한 절차의 목적은 정위 수술 특정 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 사용하여 성인 마우스 뇌 유전자 녹아웃 방법을 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

특정 시퀀스를 대상으로 올리고 하류 hU6 프로모터의 PXL 클로닝 벡터에 삽입하고, 발현 벡터는 BbsI 복제 사이트를 사용하여 가이드 RNA 지지체의 하류에있다 &quot;CRISPR / Cas9 레트로 바이러스에 대한 가이드 스트랜드 (sgRNA)를 설계하기위한 프로토콜의&quot;다음 (그림 1, 단계 1). 이 sgRNA 다음 PXL로부터 절단하고 BstBI 및 PACI 위치 (도 1, 단계 2)를 사용하여 pRubi 백본에 삽입된다. 마지막으로, 다른 sgRNA이 유전자의 또 다른 영역을 대상으로하고 NHEJ 통해 녹아웃 가능성을 증가 pRubi-Guide1 (도 1, 단계 3)에서 제 1 가이드의 하류에 배치 될 수 PXL로 클로닝. 정확한 구문 검증은 서열 분석에 의해 결정되어야한다. 이 구조가 만들어지면, 그것은 &quot;/ 역 렌티 바이러스 생산 - CaPO4 메소드 프로토콜&quot;다음 바이러스로 패키지 될 수있다. 성공적인 패키징은 V 역가를 위하여 HEK293 세포로의 바이러스 감염에 의해 확인irus. 더 형광 발현이없는 경우, 아마도 바이러스 포장 중에 오류가 있었다. 그림 2는 2 레트로 바이러스, 하나의 표현 GFP 다른 표현 mCherry의 대표 결과, (7 일짜리) 신생아 마우스의 치아 이랑에 공동 주입 및 이십일일에게 주입 후 몇 군데. mCherry 또는 GFP와 신경 세포의 표지는 단독으로 형광을 표현하는 하나의 바이러스가 CRISPR을 표현할 수 같은 조직에서 다양한 유전자 조작의 형태 학적 평가 / Cas9 매개 KO 다른 제어 바이러스를 할 수 있습니다. 정위 주입은 의도 된 좌표의 치아 이랑의 개별 감염에 의해 입증 된 바와 같이 정확한 해부학 적 선택을 할 수 있습니다. 감염 뇌 부분을 분석 할 때, 정확한 해부학 적 부위 감염되었다고 결정될 때까지 주변 조직을 유지하는 것이 중요하다. 감염의 징후가 없다면, 주입 인접 영역 발생 가능성이D는 주변 부분에서 식별 될 수있다. 또한 정확한 주입 영역을 찾기 위해 바늘 트랙을 찾는 것이 도움이 될 수있다. 생체 내 주입, 전체 치아 이랑 함께 주동이 / 꼬리 축 감염 세포를 따라 확산하는 경향이 때 3D 재구성 (그림 3)에 의해 분석으로 VSVG의 pseudotyped 바이러스는 거의 이가있는 이랑의 여백 밖으로 확산되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> 그림 1 :. 레트로 바이러스 pRubi-Guide1 - Guide2-CRISPR 플라스미드에 대한 복제 전략이 전략은 FU 기반 렌티 바이러스 플라스미드 동일합니다. sgRNA 올리고는 어닐링과 BsbI 복제 사이트를 사용하여 PXL에 삽입됩니다. 순서는 sgRNA가 성공적으로 PXL에 삽입되도록 한 후, BstBI 및 PACI와 플라스미드를 소화. (블랙 박스) 탈락되는 삽입 한 후 바이러스 다시 B로 복제됩니다하나 pRubi - Guide1 CRISPR를 (검은 색 점선). 두번째 sgRNA 또한 PXL 삽입 및 PACI 효소를 사용하여 분해 될 수있다. 이것은 다음 PACI 사이트를 사용하여 pRubi-Guide1의 CRISPR 벡터 (빨간 점선)에 복제됩니다. 생성 된 플라스미드는 가이드 가닥뿐만 아니라 필요한 바이러스 성 요소, 프로모터 및 형광 모두 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> 그림 2 :. mCherry (빨간색) 또는 GFP (녹색)를 발현하는 마우스 치아 이랑의 레트로 바이러스 주입 레트로 바이러스는 P7 마우스의 치아 이랑에 주입 하였다. 이십일일 나중에 마우스를 관류하고 뇌 단면 및 GFP 및 mCherry에 대한 염색 하였다. (A) 5 배 넓은 필드 형광 이미지는 홍보를 보여줍니다이가 이랑 주입 ecision 및 라벨 치아 이랑의 과립 신경 세포의 특이성. 해마의 형태는 DAPI (블루) 염색을 통해 알 수있다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. (B) 10 배 넓은 필드 형광 화상이 고역가 렌티 바이러스는 그 형태 형광 발현을 통해 액세스 할 수있는 다수의 셀을 감염 것을 보여준다. 스케일 바는 100 μm의를 측정한다. GFP 또는 mCherry을 표현 (C) 바이러스는 치아 이랑에 공동 주입 하였다. 레트로 바이러스의 시스템을 사용하여, 하나는 GFP 및 mCherry로 표시된 다른 조작에 의해 표시된 하나의 유전자 조작을 한 바이러스를 사용하고, 각 인한 바이러스 단일 또는 첨가제 변화를 평가할 수있다. 스케일 바는 10 μm의를 측정한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> 그림 3 :. 렌티 바이러스 주입의 해부학 적 확산 정위 공사 출<html> GFP-shPten 바이러스 및 성인의 두뇌로의 mCherry 제어 바이러스의 PTEN에 loxP / + 마우스 해마의 치아 이랑의 전체 주동이 / 꼬리 축을 따라 바이러스 확산의 결과. 이것은 바이러스의 확산 윤곽 재구성 소프트웨어를 사용하여 21 직렬 섹션 (Z = 50 ㎛의 / 제)를 통해 추적 하였다 폐쇄되는 주입의 범위의 3D 재구성에 나타낸다. 윤곽 트레이싱은 다음 볼륨 정량의 3D 이미지를 생성하기 위해 정렬했다. 전체 바이러스의 확산은 녹색으로 표시됩니다 (볼륨 = 54730800 μm의 3) 이가 지역화 확산은 (= 27,275,200 μm의 3 볼륨) 보라색에 표시됩니다. 바이러스는 니들 트랙 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 입쪽 / 꼬리 축 충전 이외에 니들 트랙 교차 뇌량 따라 퍼진다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. 레 / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; 보충 비디오 sgRNAs 1. 디자인은 레트로 바이러스와 렌티 바이러스 백본으로 복제합니다. 이 합성 가이드 RNA (sgRNA) 디자인 예제에서는 마우스 CHD8의 게놈 서열은 NCBI에서 다운로드됩니다. 개시 코돈 및 엑손 구조이어서 벡터 NTI 시각화된다. 이것은 우리가 제 1 코딩 엑손 주변의 게놈 영역을 복사 Benchling으로이 순서를 입력 할 수 있습니다. Benchling은 우리 지역의 모든 잠재적 sgRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 또한, 우리가 입력이 게놈 영역을 표시 한 후, Benchling은 우리에게 각 가이드 RNA의 대상 및 오프 목표 점수를 표시합니다. 사용자는 다음 가장 높은 온 - 오프 목표 점수 가이드 RNA를 선택할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

연구

신경과학

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

행동 신경 과학에 대한 설치류 Stereotaxic 수술과 동물 복지 성과 향상

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

LEGO 로봇에 신경 시스템 시뮬레이션을 설계 및 구현

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술<i&gt;를 통해</i&gt; 내부 경동맥

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 Transcleral 후방 접근

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...