Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Ninh conceder R01MH097949 ea Autism Speaks Pilot Grant 7359 para BWL eo Norris Cotton Cancer Center óptico de imagem Instrumentação Shared Grant P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Existem alguns passos críticos que são importantes para o empacotamento viral bem sucedida. saúde celular é fundamental antes e durante a transfecção, as células saudáveis ​​irá reduzir muito a quantidade de vírus produzida. Se a transfecção e embalagens são bem sucedidos, em seguida, 100% das células devem expressar o fluoróforo e as células devem formar um sincício funcional. No passo 3.2.4, tocando o tubo é necessário para a transfecção de título elevado de forma eficiente, e o pH da solução salina tamponada com HEPES deve ser exacta. Os maxi-preps que produzem os plasmídeos necessários para embalagem viral deve ser extremamente puro. Até este ponto, é útil para o etanol precipitar a eluição DNA final e re-suspensão em tampão Tris-EDTA. É também muito importante para reduzir a quantidade de soro de 2% ou menos, em que os meios de comunicação a cafeína é adicionado a no Dia 6 (passo 3.4) antes da recolha viral. Se o soro não é reduzida, em seguida o vírus purificado final irá conter uma quantidade indesejável de prot soroein. O uso de polietileno glicol 6000, quando precipitar as partículas virais exclui a necessidade de ultracentrifugação. É também importante notar que as CRISPR contendo vírus Cas9 tipicamente têm um título de cerca de 10 vezes menos do que os vírus que contêm exclusivamente um fluoróforo. Para a cirurgia estereotáxica, o uso de anestesia inalatória permite um controle rápido e preciso ou a consciência do animal em comparação com anestésicos injetáveis ​​e permite que a anestesia sobre uma faixa etária maior. É muito importante para manter os instrumentos cirúrgicos limpos e esterilizados, e segmentação reproduzível requer um posicionamento preciso da cabeça. Certifique-se de que não há lançamento ou de rolamento da cabeça no instrumento estereotáxico e que o crânio sente firmemente no lugar. Pode ser útil para permitir o crânio para secar, a fim de encontrar as suturas para determinar as coordenadas estereotáxicas. Além disso, a taxa e o volume de cada estereotáxico coordenar deve ser determinada empiricamente. Esta técnica é limitativo na medida em que a propagação de um retrovírus ou lenti- é restrito, especialmente quando comparado com os vírus adeno-associados (AAV) .Portanto, estes vírus são valiosos quando infectam uma região do cérebro discreta, mas não para a infecção geral associado com AAV utilizado para análise comportamental em animais. O uso de cafeína no presente protocolo aumenta consideravelmente o título destes vírus, mas ainda não são tão elevados como os titulos conseguidos no empacotamento de AAV. Além disso, a integração estável apenas uma vantagem da expressão fluoróforo, como CRISPR / Cas9 forma edições genómicas estáveis ​​mesmo quando transitoriamente transfectadas e é possível que em curso expressão do Cas9 sgRNA e podem, eventualmente, produzir efeitos fora do alvo. A expressão transiente do sistema / Cas9 CRISPR com AAV é suficiente para produzir alterações genómicas que se propagam ao longo de divisões celulares, no entanto, não irá ser mantida expressão fluoróforo. Criação de lenti- e retrovírus utilizando o sistema CRISPR / Cas9 irá conferir a capacidade de ter como alvo qualquer novo gene em uma ampla variedade de organismos. A eficiência de edição gene parece ser dependente da sequência do ARN alvo a guia de clivagem Cas9. Foi determinado empiricamente que entre 10% e 80% dos clones contêm indels após sequenciação infectadas células Neuro2A. É atualmente desconhecido se freqüências InDel calculados em células Neuro2A refletem aqueles em neurônios. Guia de software de criação de ARN, tal como Benchling agora incluem uma avaliação &quot;on-alvo&quot; que pode ser capaz de prever a eficácia de uma determinada sequência alvo. Até que ponto tais resultados &quot;no alvo&quot; são necessidades confiáveis ​​para ser empiricamente determinados em neurônios e outros tipos celulares como o sistema CRISPR-Cas9 se torne mais amplamente implementadas. produção animal transgénico baseado em lentivírus tem sido variavelmente bem sucedido com relatos de que os transgenes entregou-lentivírus se tornar silenced 11. CRISPR de genes mediada edição de ADN pode ser passada através da linha germinativa para gerar modelos animais completos. Assim, a edição genômica estável pode ser viável, apesar do silenciamento de fluoróforos virais entregue e transgenes Cas9. Isto pode fornecer uma plataforma eficiente para alterações genômicas alvejados. A entrega viral do sistema / Cas9 CRISPR, embora não exija organismos transgénicos, é complementar a estas técnicas. Por exemplo, a injecção de tais partículas virais em um animal transgénico que expressa composto indutivelmente Cre e Cre opto dependente ou quimio-transgenes genética deve facilitar estudos de complexos sobre a relação entre as manipulações genéticas e actividade neuronal. Um segundo exemplo é o de proporcionar estas partículas virais Cas9 / sgRNA em um nocaute condicional numa tentativa para pesquisar as interacções do gene para o gene. Finalmente, uma outra rota emocionante da pesquisa é a triagem de fenótipos e compostos terapêuticos em células do paciente derivada, que podeser utilizados para validar e descobrir redes genéticas que são rompidas em várias doenças.

Para estudar a base da fisiologia normal e patologia da doença, há uma necessidade de manipular com precisão a expressão de genes em organismos modelo. Para os organismos modelo mamífero, isto é, em grande parte centrado sobre a criação e desenvolvimento de ratinhos transgénicos em que um elemento genético de interesse é flanqueado por sítios reconhecidos por uma recombinase. Isto pode resultar em um sítio específico manipulação destes genes flanqueados. Embora esta tenha sido uma estratégia bem sucedida, é tempo e recursos intensivos; por exemplo, a criação de um animal transgénico tripla que expressam um gene floxed, a recombinase Cre e um gene repórter Cre requer múltiplos cruzamentos e validação. Em contraste, a injecção estereotáxica de replicação de partículas virais defeituosas que codificam uma proteína fluorescente e a recombinase num animal gene floxed não requer estratégias de melhoramento 1 genotipagem ou complexo. Além disso, se uma proteína fluorescente e Cre que expressa vírus é co-injectado com um segundo vírus ENCOding uma proteína fluorescente diferente, então isso fornece um controle dentro do tecido para a manipulação genética alvo. Embora esta estratégia ainda exige o uso de animais knock-in, estratégias de ARN baseado viralmente mediadas contornar a necessidade de animais transgénicos. Por exemplo, a injecção estereotáxica de vírus deficientes na replicação que codificam uma proteína fluorescente e um ARN de gancho de cabelo curto (shRNA) pode utilizar endógena máquinas ARNi da célula para resultar em uma redução potente da transcrição de um gene de interesse. No entanto, as estratégias de shRNA produzir genes sutil knock-baixos, muitas vezes resultando em modestos fenótipos celulares 2. Enquanto um knock-down pode ser mais fisiologicamente relevante para a disfunção do gene heterozigótica, a sua robustez diminuiu em comparação com um knock-out não é ideal para a descoberta de novos genes fenotípica. Uma terceira técnica que surgiu recentemente, o CRISPR (cluster regularmente espaçadas Repita Palindromic Short) / Cas9 (CRISPR-associadoproteína 9) do sistema, baseia-se na expressão de tanto um pequeno RNA exógeno e um enzima corte o ADN. O sistema / Cas9 CRISPR foi adaptado a partir do sistema imunitário evoluiu procariotas que um método de identificação externa, invadir o ADN de vírus e orientando-o para a degradação através da enzima Cas9 3,4. Esta técnica poderosa edição genoma pode ser utilizado para a criação de deleções, inserções, segmentados e mutações; e o seguinte protocolo irá descrever como fazer deleções no gene de interesse, a fim de knockout a sua expressão in vivo. A enzima Cas9 deve ser expressa com uma guia de ARN homólogo à região de interesse e contígua com um ARN de andaime. Knockout de um gene utilizando esta técnica requer a segmentação Cas9 para uma região específica do genoma, utilizando ARN de orientação sintéticos (sgRNA), e indução de quebras de cadeia dupla (DSB) no sítio de interesse. Estes LAP são então reparado pela maquinaria celular reparação endógena via não homóloga-end juntar (NHEJ) que leanúncio para indels que podem produzir missense ou sem sentido mutações e pode, portanto, criar uma perda de expressão da proteína funcional 5. Uma vez que este sistema produz alterações genómicas, que exige apenas a expressão transiente do Cas9 e sgRNA. No entanto, é desejável que um indicador fluorescente estável para identificar as células e a sua progenia manipuladas deste modo. Lenti- retrovírus e tem a vantagem de integrar de forma estável de ADN de interesse em células hospedeiras que mantêm a expressão de longo prazo e são passados ​​para baixo para as células filhas durante a mitose. Este protocolo descreve a concepção e produção de dois tipos de replicação defeituosa, retrovírus título elevado: o vírus da imunodeficiência humana partículas lentivirais derivados (lentivírus) e aqueles baseados em vírus Maloney da leucemia de murino (retrovírus). Embora ambos estes vírus são capazes de suportar estáveis ​​que expressam transgenes de grandes, as partículas retrovirais só pode integrar-se no genoma dudivisão celular anel com a degradação do envelope nuclear, e, portanto, pode ser usado como uma ferramenta para etiquetar e células data de nascimento 6. Enquanto lentivírus têm uma reputação de ser relativamente baixo título 7, esta metodologia, incluindo o uso de cafeína 8 durante a coleta viral, rotineiramente produz títulos de 10 9 e 10 10 partículas / ml. Outra vantagem de lenti- e retrovírus é a tolerância para muito grandes inserções. O seguinte conjunto de protocolos descreve o procedimento para a concepção de um Lenti ou retrovírus que codifica um repórter fluorescente, sgRNAs, e Cas9 para utilizar o sistema / Cas9 CRISPR para modificar o ADN, bem como expressar uma proteína fluorescente. Rato neurocirurgia estereotáxica é um método valioso para injetar vírus in vivo para estudo da morfologia, função e conectividade dos neurônios infectados. A infecção viral nos neurónios podem ser usadas para manipular os níveis de expressão ao longo de um período prolongado de timE, tal como ao longo do desenvolvimento, e a expressão pode ser controlada com precisão através da utilização de vários sistemas indutíveis drogas e expressão específica orientada Cre. Este protocolo particular explica como injetar um vírus expressando uma sgRNA e Cas9 para nocautear um gene de interesse no cérebro de um rato adulto. Os ratinhos recuperam muito rapidamente a partir deste procedimento e a expressão do transgene viral pode ser visto dentro de pós-injecção de 48 horas. No entanto, a expressão fluoróforo parece aumentar ao longo de semanas, resultando em níveis máximos próximos por 3 semanas pós-infecção. Os ratos que sofrem de injecção estereotáxica viral pode ser utilizada para o comportamento, electrofisiologia, ou estudos morfológicos. No geral, o objectivo destes procedimentos é demonstrar como a nocaute um gene no cérebro do rato adulto usando cirurgia estereotáxica e um vírus expressando um sgRNA específico e Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

Seguindo o &quot;Protocolo para a concepção de um Guia Strand (sgRNA) para CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, são inseridos os oligos alvo uma sequência particular no vector PXL clonagem a jusante do promotor hU6 e a jusante de um andaime de ARN guia utilizando os locais de clonagem Bbsl (Figura 1, passo 1). Este sgRNA é então excisada do PXL e inserido na coluna vertebral pRubi utilizando os locais PacI e BstBI (Figura 1, Passo 2). Finalmente, um outro sgRNA clonado PXL pode ser colocado a jusante do primeiro guia em pRubi-Guide1 (Figura 1, Passo 3), tendo como alvo uma outra área do gene e aumentar as chances de um nocaute via NHEJ. Verificação das construções de correcção deve ser determinada por análise da sequência. Uma vez que esta construção é feito, que pode ser empacotado em um vírus seguindo o &quot;Protocolo para Retro / Lentivirus produção- Método CaPO4&quot;. embalagem bem sucedida é confirmada pela infecção de vírus em células HEK293, a fim de titular a vIrus. Se não houver nenhuma expressão fluoróforo então provavelmente houve um erro durante o acondicionamento do vírus. A Figura 2 é um resultado representativo de 2, um retrovírus que expressa GFP e a outra expressando mCherry, co-injectados no giro dentado de rato neonatal (7 dias de idade) e fotografada 21 dias pós-injecção. A marcação de neurónios com mCherry ou GFP permite a avaliação morfológica de várias manipulações genéticas no mesmo tecido, em que um vírus podem expressar um CRISPR / Cas9 mediada KO e a outra um vírus de controlo, que expressam apenas um fluoróforo. injecção estereotáxica permite selectividade anatómica precisa, como demonstrado pela infecção discreta das coordenadas destinadas, no giro dentado. Ao analisar secções do cérebro para a infecção, é importante para manter o tecido circundante até que seja determinado que a região anatómica correcta foi infectado. Se não houver nenhum sinal de infecção, então é possível que a injecção ocorreu em um uma região vizinhad pode ser identificado nas secções vizinhas. Também pode ser útil para localizar o percurso da agulha para encontrar a região exacta de injecção. Vírus pseudotipados VSVG raramente se espalha para fora das margens do giro dentado, quando injectado in vivo, e tendem a espalhar-se as células infectar eixo rostral / caudal ao longo de todo o giro denteado, tal como analisado por reconstrução 3D (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Estratégia de clonagem para o plasmídeo pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR retroviral Esta estratégia é idêntico para os plasmídeos lentivirais baseados-FU. oligos sgRNA são recozidos e inserido PXL utilizando os locais de clonagem BSBI. Após sequenciação para assegurar que o sgRNA é inserido com sucesso em PXL, digerir o plasmídeo com BstBI e PacI. A inserção que é deixado cair fora (caixa preta) é então clonado na parte traseira b viralum (preto linhas pontilhadas) pRubi-Guide1 CRISPR. Um segundo sgRNA também pode ser inserido PXL e digerido usando a enzima PacI. Este é então clonado no vector CRISPR pRubi-Guide1 (vermelho linhas pontilhadas), utilizando o local PacI. O plasmídeo resultante, em seguida, contém ambos os fios de guia, bem como os elementos virais necessárias, promotores e fluoróforos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. Retroviral de injecção do giro dentado do rato Os retrovírus que expressam mCherry (vermelho) ou GFP (verde) foram injectados no giro dentado de um ratinho P7. 21 dias mais tarde, os ratinhos foram perfundidos e os cérebros seccionados e corados para GFP e mCherry. (A) Uma imagem fluorescente de campo amplo 5X mostra o PRECISÃO da injeção giro denteado e a especificidade da rotulagem dentados neurônios giro granulares. A morfologia do hipocampo pode ser visto através do DAPI (azul) coloração. Barra de escala mede 200 um. (B) Uma imagem fluorescente 10X de campo amplo demonstra que estes lentivírus alto título infectar um grande número de células cuja morfologia pode ser acessado via expressão fluoróforo. Barra de escala mede 100 mm. (C) Os vírus expressando GFP ou mCherry foram co-injectado no giro dentado. Utilizando um sistema de retrovírus, pode-se usar um vírus para fazer uma manipulação genética marcada por GFP e outra manipulação marcado por mCherry, e depois avaliar as mudanças individuais ou aditivos devido a cada vírus. Barra de escala mede 10 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Propagação anatômica de injecção lentiviral coinjection estereotáxica<html> de um vírus GFP-shPten e um controle de vírus mCherry no cérebro de um adulto Pten loxP / rato + resultou num propagação virai ao longo do eixo rostral toda / caudal do giro dentado do hipocampo. Isto é mostrado de uma reconstrução 3D da extensão da injecção em que fechada contornos da propagação virai foram traçados ao longo de 21 secções em série (z = 50 um / secção), usando software de reconstrução. Os traçados de contorno foram então alinhados para gerar as imagens 3D para quantificação volume. Propagação viral total é mostrado em verde (volume = 54.730.800 mm 3) e disseminação localizada-denteado é mostrado em roxo (volume = 27.275.200 mm 3). O vírus propaga-se ao longo do percurso da agulha e do corpo caloso, na intersecção da pista de agulha além de preencher o eixo rostral / caudal do giro dentado. Barra de escala mede 200 um. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Suplementar vídeo 1. Projeto de sgRNAs para clonar no backbone retroviral e lentiviral. Neste exemplo de design RNA guia sintética (sgRNA), a sequência genômica de CHD8 mouse é baixado do NCBI. O códon de iniciação e da estrutura exão são então visualizados em Vector NTI. Isso nos permite copiar a região genômica em torno do primeiro exão de codificação e entrar nesta seqüência em Benchling. Benchling nos permite visualizar todos os sgRNAs potenciais na região. Além disso, depois de indicar a região genômica temos entrada, Benchling vai nos mostrar as pontuações on-alvo e fora do alvo para cada RNA guia. O usuário pode então selecionar a RNA guia com as maiores pontuações dentro e fora do alvo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Neurociência

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Cirurgia estereotáxica de roedores e animais Melhorias Resultado do Bem-Estar de Neurociência Comportamental

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

Projetando e implementando Simulações do Sistema Nervoso em LEGO Robots

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC<i&gt; via</i&gt; Artéria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano<i&gt; via</i&gt; Uma abordagem transcleral Posterior

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...