Name: designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Нинь грант R01MH097949 и Аутизм Говорит Pilot Грант 7359 до BWL и Норрис хлопок онкологического центра оптических изображений Shared Инструментарий Грант P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Есть несколько важных шагов, которые имеют важное значение для успешной вирусной упаковки. здоровье Ячейка имеет решающее значение до и во время трансфекции, как нездоровое клетки значительно уменьшит количество вируса производится. Если трансфекцию и упаковки успешны, то 100% клеток должны выразить флуорофора и клетки должны образовывать функциональный синцитий. На шаге 3.2.4, коснувшись трубу необходимо для высокого титра трансфекцией эффективно, и рН HEPES-буферном солевом растворе, должно быть точным. Макси-Preps, которые производят плазмид, необходимые для вирусной упаковки должны быть очень чистыми. С этой точки, полезно в этанол осадить окончательное элюирование ДНК и повторно приостанавливать в буфере Трис-ЭДТА. Кроме того, очень важно, чтобы уменьшить количество сыворотки на 2% или менее, в средствах массовой информации о том, что кофеин добавляется к на 6-й день (этап 3.4) перед вирусной коллекции. Если сыворотка не уменьшается, а затем окончательно очищенный вирус будет содержать нежелательный количество сыворотки PROTEin. Применение полиэтиленгликоля 6000 при осаждении вирусных частиц исключает необходимость ультрацентрифугирования. Важно также отметить, что cas9 CRISPR, содержащие вирусы, как правило, имеют титр около 10 раз меньше, чем вирусы, содержащие только флуорофор. Для стереотаксической хирургии, использование вдыхаемого анестезии позволяет быстро и точно контролировать или сознание животного по сравнению с инъекционными анестетиков и позволяет анестезии в более широком диапазоне возраста. Очень важно, чтобы держать хирургические инструменты чистыми и стерильными, и воспроизводимое нацеливание требует точного позиционирования головки. Убедитесь, что нет качка или прокатка головы в стереотаксической инструмента и что череп чувствует себя твердо на месте. Это может быть полезным, чтобы позволить череп высохнуть, чтобы найти швы, чтобы определить стереотаксической координаты. Кроме того, скорость и объем для каждого стереотаксической координат должны быть определены эмпирически. Этот метод ограничивает в том, что распространение в lenti- или ретровируса ограничено, особенно по сравнению с аденосателлитные вирусами (AAVs) .Therefore, эти вирусы являются ценными при заражении дискретную область мозга, но не для общей инфекции, связанные с AAVs используется для анализа поведения у животных. Использование кофеина в этом протоколе значительно повышает титр этих вирусов, но они все еще не так высок, как титрами, достигнутыми в AAV упаковке. Кроме того, стабильная интеграция является лишь преимуществом выражения флуорофора, так как CRISPR / cas9 образует стабильные геномные редактирует даже при трансфицированы, и возможно, что продолжающийся экспрессию cas9 и sgRNA могут в конечном счете привести к возникновению посторонних целевых эффектов. Переходная выражение CRISPR / cas9 система с AAVs достаточно для получения геномных изменений, которые распространяются по всему клеточных делений, тем не менее, экспрессия флуорофор не будет поддерживаться. Создание Lenti- и ретровирусы, использующие / системы cas9 CRISPR будет придавать способность обнаружить любую новый ген в самых разнообразных организмов. Эффективность редактирования гена по-видимому, зависит от последовательности направляющей РНК, нацеленной на расщепление cas9. Эмпирически было установлено, что от 10% до 80% клонов содержат вставкам после того, как секвенирование инфицированных клеток Neuro2A. Это в настоящее время неизвестно, будет ли INDEL частоты, вычисленные в клетках Neuro2A отражают те, в нейронах. Руководство РНК разработки программного обеспечения, такие как Benchling в настоящее время включают в себя &quot;на-мишень&quot; счет, который может быть в состоянии предсказать эффективность данной целевой последовательности. В какой степени такие &quot;по-мишени&quot; забивает надежные потребности быть определены эмпирически в нейронах и других типов клеток, как система CRISPR-cas9 становится все более широко реализуются. Лентивирус на основе трансгенных животных было успешным переменно с сообщениями, что лентивирусов доставляемого трансгены стать сиlenced 11. CRISPR редактирование опосредованной ген ДНК может быть пропущен через зародышевую линию, чтобы генерировать целые модели на животных. Таким образом, стабильная геномная редактирования может быть достигнута, несмотря на замалчивания вирусными доставляемого флуорофоров и cas9 трансгенов. Это может обеспечить эффективную платформу для целевых геномных изменений. Вирусный поставка CRISPR системы / cas9, в то время как не требующий трансгенных организмов, является дополнением к этим методам. Например, потребители инъекционных таких вирусных частиц в соединение трансгенного животного, которое индуцибельно выражающего Cre и Cre зависимой опто- или химио-генетический трансгены должны способствовать комплексные исследования в взаимосвязи между генетическими манипуляциями и нейронную активность. Вторым примером является доставить эти вирусные частицы cas9 / sgRNA в условном нокаута в попытке скрининга для генно-генных взаимодействий. И, наконец, еще один захватывающий маршрут этого исследования является скрининг фенотипов и терапевтических соединений в клетках пациента происходит, что можетиспользоваться для проверки и обнаружить генетические сети, которые нарушаются при различных заболеваниях.

Изучить основы нормальной физиологии и патологии болезни, существует необходимость точно манипулировать экспрессии генов в модельных организмах. Для модельных организмов млекопитающих, это в значительной степени сосредоточены на создании и развитии трансгенных мышей, в которых генетический элемент, представляющий интерес, в окружении сайтов, признанных рекомбиназы. Это может привести к участкам, манипулирование этими генами фланкированные. Хотя это была успешная стратегия, настало время и ресурсоемким; например, создание тройной трансгенного животного, которое выражало бы floxed ген, Cre рекомбиназу и ген-репортер Cre требует многократных спариваний и проверки. В противоположность этому , стереотаксической инъекции репликации дефектных вирусных частиц , кодирующие флуоресцентный белок и рекомбиназу в floxed гена животного не требует сложного генотипирование или стратегий разведением 1. Кроме того, если флуоресцентный белок и Cre экспрессирующих вирус совместно вводят со вторым вирусом ENCOдинь другой флуоресцентный белок, то это обеспечивает контроль внутри ткани-мишени для генетических манипуляций. В то время как эта стратегия по-прежнему требует использования нокаута в животных, вирусно опосредованные стратегии РНК на основе обойти потребность в трансгенных животных. Например, стереотаксической инъекции репликации с дефицитом вирусов, которые кодируют флуоресцентный белок и короткий шпилька РНК (shRNA) могут использовать эндогенные RNAi оборудование ячейки приведет к мощному снижению транскрипта гена. Тем не менее, стратегии shRNA производят тонкие ген нокдаунов часто приводит к скромных клеточных фенотипов 2. В то время как нокдауна может быть более физиологически актуально для гетерозиготной дисфункции гена, его уменьшилась прочность по сравнению с нокаута не является идеальным для фенотипического открытия новых генов. Третий метод, который недавно появился, то CRISPR (Кластерный Регулярно Interspaced Короткие палиндромных Repeat) / cas9 (CRISPR-ассоциированныйбелок 9) система, опирается на экспрессию как небольшой экзогенной РНК и режущим ДНК фермента. Система / cas9 CRISPR был адаптирован из прокариот иммунной системы , которая эволюционировала способ идентификации иностранных, вторгаясь ДНК от вирусов и ориентации его на деградацию с помощью фермента cas9 3,4. Этот мощный метод редактирования генома может быть использован для создания целевых делеции, инсерции и мутации; и следующий протокол будет кратко описано , как сделать делеции в гене интереса для того , чтобы с выбыванием свое выражение в естественных условиях. Фермент cas9 должен быть выражен с направляющей РНК , гомологичные области , представляющей интерес и смежных с подмостей РНК. Нокаут гена с помощью этого метода требует ориентации cas9 для конкретного региона в геноме с использованием синтетических направляющих РНК (sgRNA), и вызывая двухцепочечные разрывы (DSBs) на сайте интерес. Эти DSBs затем ремонтироваться эндогенного клеточно-ремонтной техники через негомологичный конечного присоединения (NHEJ), который леобъявления вставкам , которые могут производить миссенс или нонсенс - мутации и , следовательно , может создать потерю экспрессии функционального белка 5. Так как эта система производит геномные изменения, он требует только временной экспрессии cas9 и sgRNA. Тем не менее, желательно, чтобы стабильная флуоресцентного индикатора для идентификации клеток и их потомство манипулируют таким образом. Lenti- и ретровирусы имеют преимущество стабильно интегрировать интерес ДНК в клетки-хозяева, которые поддерживают долгосрочное выражение и которые передаются дочерним клеткам во время митоза. Этот протокол описывает конструкцию и производство двух типов репликации дефектной, высокий ретровирусов титром: вирус иммунодефицита человека, полученные лентивирусов частицы (лентивирусные) и те, которые основаны на мышиной лейкемии Мэлони вируса (ретровируса). В то время как оба из этих вирусов способны поддерживать стабильный выражения больших трансгенов, ретровирусные частицы могут включать только в геном дюделение клеток кольцо с деградацией ядерной оболочки, и , следовательно , может быть использован в качестве инструмента для обозначения и дата рождения 6 ячеек. В то время как лентивирусов имеют репутацию относительно низкий титр 7, эта методология, в том числе использование кофеина 8 во время вирусной коллекции, обычно производит титры 10 9 и 10 10 частиц / мл. Еще одно преимущество lenti- и ретровирусов является допуском для очень больших вставок. Следующий сборник протоколов описывает процедуру для разработки Ленти или ретровирус, кодирующий флуоресцентный репортер, sgRNAs и cas9, чтобы использовать систему CRISPR / cas9 модифицировать ДНК, а также выразить флуоресцентный белок. Мышь стереотаксической нейрохирургии является ценным методом для инъекций вирусов в естественных условиях для изучения морфологии, функции и связность инфицированных нейронов. Вирусные инфекции в нейронах могут быть использованы для манипулирования уровнями экспрессии в течение длительного периода ТИМае, такие, как в ходе развития, и выражение можно точно контролировать путем использования различных лекарственных индуцируемых систем и специфической ведомой экспрессии Cre. Этот конкретный протокол объясняет, как внедрить вирус, экспрессирующие sgRNA и cas9 нокаутировать представляющий интерес ген в мозге взрослого мыши. Мыши восстанавливаться очень быстро от этой процедуры и экспрессии вирусных трансгенов можно увидеть в течение 48 часов после инъекции. Тем не менее, флуорофор выражение, как представляется, увеличиваются в течение нескольких недель, в результате вблизи максимальных уровней на 3 недели после заражения. Мыши, которые претерпевают вирусный стереотаксической инъекции могут быть использованы для поведения, электрофизиологии или морфологических исследований. В целом, цель этих процедур заключается в демонстрации того, как нокаутировать ген в мозге взрослых мышей с помощью стереотаксической хирургии и вирус, выражающую определенную sgRNA и cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

После &quot;Протокол для разработки Руководство Strand (sgRNA) для CRISPR / cas9 ретровируса&quot;, олигонуклеотиды таргетингом конкретную последовательность встраивают в PXL клонирующий вектор вниз по течению промотора hU6 и после направляющей РНК эшафот с использованием сайтов клонирования BbsI (рис 1, этап 1). Это sgRNA затем вырезают из PXL и вставляется в основной цепи pRubi , используя сайты BstBI и Пачи (рисунок 1, шаг 2). Наконец, еще один sgRNA клонировали в PXL может быть размещен ниже по потоку от первой направляющей в pRubi-Guide1 (Рисунок 1, стадия 3), нацеливание другую область гена и увеличивает шансы на нокаут через NHEJ. Проверка правильности конструкций, должны быть определены с помощью анализа последовательности. После того, как эта конструкция выполнена, она может быть упакована в вирус после &quot;Протокол для ретро / Lentiviral производство- CaPO4 метод». Успешная упаковка подтверждается инфекцией вируса в клетках НЕК293, чтобы титровать клиновойирус. Если нет, то выражение флуорофор скорее всего, была ошибка во время упаковки вируса. Рисунок 2 является представителем результатом 2 ретровирусы, одного , выражающего GFP и другой , выражающей mCherry, совместно вводили в зубчатую извилину у новорожденных мышей (7 дневного возраста) и 21 отображены дней после инъекции. Маркировку нейронов с mCherry или GFP позволяет морфологическая оценка различных генетических манипуляций в той же ткани, где один вирус может выразить CRISPR / cas9 опосредованного KO, а другой вирус управления, выражая исключительно флуорофор. Стереотаксическая инъекция позволяет точно анатомическую селективность, как продемонстрированные дискретной инфекции предполагаемых координат, зубчатой ​​извилине. При анализе участков мозга для инфекции, важно держать окружающих тканей до тех пор, пока не будет установлено, что правильная анатомическая область была заражена. Если нет признаков инфекции, то возможно, что инъекции произошел в соседнем регионе А.Н.d могут быть идентифицированы в окружающих участках. Она также может быть полезно, чтобы найти иглы трек, чтобы найти точную область инъекции. Вирусы pseudotyped VSVg редко распространяются из окраин зубчатую извилину при введении в естественных условиях, и имеют тенденцию распространяться вдоль ростральных / каудальной оси инфицировать клетки вдоль всей зубчатую извилину, как было проанализировано с помощью 3D реконструкции (рисунок 3). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Клонирование стратегия для ретровирусов pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR плазмиды Эта стратегия идентична для ФУ на основе лентивирусов плазмид. sgRNA олигонуклеотиды отжигают и встраивают в PXL , используя сайты клонирования BsbI. После того, как секвенирование , чтобы гарантировать , что sgRNA успешно вставлен в PXL, переваривают плазмиду с BstBI и PacI. Вкладыш, который выпал из (черный ящик), затем клонировали в вирусный обратно бодин (черный пунктирные линии) pRubi-Guide1 CRISPR. Второй sgRNA также могут быть вставлены в PXL и переваривают с помощью фермента PacI. Это затем клонировали в вектор CRISPR pRubi-Guide1 (красные пунктирные линии) с помощью сайта PacI. Затем полученную плазмиду содержит обе нити направляющие, а также необходимые вирусные элементы, промоутеров и флуорофоров. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Рисунок 2:. Ретровирусное инъекция мыши зубчатой ​​извилине ретровирусы , выражающие mCherry (красный) или GFP (зеленый) вводили в зубчатую извилины p7 мыши. 21 дней спустя мыши были перфузию и мозги секционного и окрашивают для GFP и mCherry. (A) 5х широкоугольным поле флуоресцентное изображение показывает прecision зубчатой ​​извилины инъекции и специфичность маркировки зубчатыми нейронов извилине гранул. Морфология гиппокампа можно увидеть через (синий) окрашивания Dapi. Шкала бар измеряет 200 мкм. (В) , 10 - кратный широкоугольный поле флуоресцентное изображение показывает , что эти высокие лентивирусов титр заражать большое число клеток, морфология которых можно получить с помощью выражения флуорофора. Шкала бар измеряет 100 мкм. (C) Вирусы , экспрессирующие GFP или mCherry были совместно вводят в зубчатой ​​извилине. Используя систему ретровирусов, можно использовать один вирус для того чтобы сделать один генетических манипуляций, отмеченный GFP и другим манипуляциям, отмеченного mCherry, а затем оценить одну или аддитивных изменения из-за каждого вируса. Шкала бар измеряет 10 мкм. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Рис . 3: Анатомический распространение лентивирусов инъекции стереотаксическая соинжекцию<html> вируса GFP-shPten и контрольного вируса mCherry в мозг взрослого PTEN LoxP / + мышь привела к вирусным разбросанным по всей ростральной / каудальной оси зубчатую извилину гиппокампа. Это показано в 3D - реконструкции степени инжекции , в котором замкнутые контуры вирусного распространения были прослежены в течение 21 последовательных секций (Z = 50 мкм / раздела) , с использованием программного обеспечения восстановления. Контурные обводка затем выравниваются для создания 3D-изображений для объема количественной оценки. Общее распространение вируса показан зеленым цветом (объем = 54730800 мкм 3) и распространение зубчатая локализованы показан в фиолетовый (объем = 27275200 мкм 3). Вирус распространяется вдоль траекторией иглы и мозолистого на пересечении траекторией иглы в дополнение к заполнению ростральной / каудальной оси зубчатую извилину. Шкала бар измеряет 200 мкм. ле / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Справочная Видео 1. Проектирование sgRNAs для клонирования в ретровирусов и лентивирусов позвоночника. В этом синтетический руководство РНК (sgRNA) конструкции, например, геномная последовательность CHD8 мыши загружается из NCBI. Стартовый кодон и структура экзон затем визуализируется в Vector NTI. Это позволяет копировать геномную область вокруг первого экзона кодирования и ввести эту последовательность в Benchling. Benchling позволяет визуализировать все потенциальные sgRNAs в регионе. Кроме того, после того, как указывает на геномную область у нас есть вход, Benchling покажет нам баллы по-мишени и вне мишени для каждой направляющей РНК. После этого пользователь может выбрать направляющую РНК с самым высоким и офф-мишени баллов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Проектирование, Упаковка и доставка высокий титр CRISPR Retro и Лентивирусов через стереотаксической инъекции

Система / cas9 CRISPR предлагает потенциал, чтобы сделать редактирования целенаправленный генома доступной для научного сообщества. Этот протокол предназначен для демонстрации того, как создать вирусы, которые будут с выбыванием представляющий интерес ген, используя систему CRISPR / cas9, а затем применить их стереотаксическим в мозг взрослых мышей.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Гена Доставка в послеродовой мозга крысы по Non-желудочковой плазмиды инъекция и Электропорация

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Грызун стереотаксической хирургии и животных улучшения благосостояния Итоговом документе Поведенческие Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em&gt; В Utero</em&gt; Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

Проектирование и реализация системы Нервная Симуляторы на LEGO роботы

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Стереотаксическая Настой олигомерных бета-амилоида в гиппокампе мыши

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Mouse микрохирургии Настой Техника для Targeted вещества Доставка в ЦНС<i&gt; с помощью</i&gt; Артерию внутренней сонной

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Инъекционный метод Альтернативный и Validated для доступа субретинальной пространства<i&gt; с помощью</i&gt; Подход склеру Задней

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Доставка антител в мозг Мурин через конвекционно-увеличенную доставку

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

Индукция Leptomeningeal клеток Модификация через интрасистскую инъекцию

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...