Name: optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons at JoVE.com

We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Alle Verfahren in der aktuellen Studie wurden unter Verwendung von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt Protokolle für die Behandlung der Tiere für biologische Studien, La Jolla, CA am Salk Institute genehmigt 1. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des resultierenden PIRK in den Primary Neuronal Culture <ol><li> DNA-Konstruktion <ol><li> Wählen Sie eine Zielstelle von Kir2.1 für Uaa Einbau. Exploit vor Wissen und Informationen über Struktur und Funk...

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Um eine effektive Photomodulations erreichen, ist der erster wichtiger Schritt, um zu entscheiden, wo das Licht ansprechende Uaa in dem Zielprotein zu integrieren. Strukturelle und funktionelle Informationen des Zielproteins ist sehr hilfreich, um die Auswahl von Kandidaten Seiten zu führen. Zugleich würde der Zweck der Lichtregulierung bestimmen, welche Seite am besten geeignet ist. Nach der Auswahl von Kandidaten - Websites, empfehlen wir die Standorte in Säugetierzelllinien wie die menschliche embryonale Nieren (H...

Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation bietet Photo größere zeitliche und räumliche Auflösung bei minimaler Störung des physiologischen Systems von Proben. Seit der Demonstration Laser mit Neuronen im Jahr 1971 1, viele kreative Möglichkeiten zu stimulieren erfunden worden exogen mit Licht neuronale Aktivität zu kontrollieren. Optische Freisetzung von photoaktivierbaren Agonisten ist seit langem verwendet worden , um Liganden 2,3,4 physiologische Antwort des neuronalen Netzes zu untersuchen. Diese Technik hat Spezifität begrenzt durch Diffusion von caged-Agonisten. Genetische Spezifität wird durch ektopisch exprimieren , lichtempfindliche Opsin Kanäle erreicht und Pumpen 5,6,7, und es wurde erfolgreich zu modulieren ausgewählte neuronale Netzwerke in verschiedenen Modellorganismen eingesetzt. Allerdings würde es schwierig sein, diese Methode anzuwenden, optisch auf verschiedene andere neuronale Proteine ​​steuern, da Photoreaktivität von den Opsin Proteinen an andere Proteine ​​Pfropfung would intensiv Engineering erfordern, die die natürlichen Eigenschaften des Proteins untersuchten verändern können. Chemisch Anbindehaltung ein exogener lichtempfindlichen Ligand an ein Protein einen anderen Weg , um die Funktionalität von Kanalproteinen 8,9,10 zu steuern unter Beweis gestellt hat. Der Ligand wird präsentiert oder von der Bindungsstelle des Proteins durch die Photoisomerisierung des Azobenzoleinheit zurückgezogen. Anbinden Chemie beschränkt die Anwendung vor allem auf der extrazellulären Seite der Membranproteine, mit Ausnahme der intrazellulären Seite und intrazellulären Proteinen. Lichtempfindliche UAAs, nachdem sie in Proteine ​​eingebaut werden, eine allgemeine Strategie Proteine ​​mit Licht zu manipulieren. In frühen Bemühungen, tRNAs chemisch acyliert mit photoaktivierbaren UAAs in Xenopus - Oozyten mikroinjiziert wurden 11, die UAAs in Membranrezeptoren und Ionenkanäle zu integrieren , die das Verständnis ihrer Struktur-Funktionsbeziehungen 12,13,14 vorangebracht haben.Diese Mikroinjektions Ansatz ist vor allem auf große Eizellen begrenzt. Genetische Einbau eines Uaa umgeht die technisch anspruchsvolle tRNA Acylierung und die Mikroinjektion durch eine orthogonale tRNA / Synthetase - Paar verwenden, die die Uaa durch endogene Proteintranslation in lebenden Zellen 15,16,17,18 enthält. Uaa Einbau in neuronale Proteine ​​wurde in primären Neuronen und neuronalen Stammzellen 19,20 demonstriert. In jüngerer Zeit wurde auf Licht ansprechende Uaa genetisch in ein neuronales Protein im Gehirn von Säugetieren in vivo zum ersten Mal 21 eingebaut. Diese Fortschritte ermöglichen es, neuronale Proteine ​​mit UAAs in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal Kir2.1 ist ein starker Gleichrichter, der K + -Ströme mehr geht leicht in als aus der Zelle, und es ist wichtig bei der Regulierung der physiologischen Prozessen einschließlich Zell Erregbarkeit, Gefäßtonus, Herzfrequenz, renal Salzfluss und Insulinfreisetzung 22. Überexpression von Kir2.1 hyperpolarisiert die Membranpotential des Zielneurons, das weniger erregbar 23,24 wird. Optisch Kir2.1 in seiner nativen Zellen kontrollieren, Kang et al. Genetisch a photo-responsive Uaa in Kir2.1 inkorporiert in Säugerzellen exprimiert, Neuronen und embryonalen Maushirnen 21. Ein kurzer Lichtimpuls konnte die Uaa in einer natürlichen Aminosäure Cys, wodurch die Ziel Kir2.1-Protein aktivierenden zu konvertieren. Wenn diese fotoinduzierbaren einwärtsgleichrichtenden Kalium (PIRK) Kanalprotein in Ratten-Hippocampus primäre Neuronen exprimiert wurde, unterdrückt es neuronale Aktivität in Reaktion auf Lichtaktivierung. Außerdem wurde gemessen, die PIRK Kanal wurde in der embryonalen Maus Neocortex und das lichtaktivierte PIRK Strom in kortikalen Neuronen exprimiert. Die erfolgreiche Umsetzung der Uaa Technologie in vivo im Gehirn von Säugetieren öffnet die Tür zu optisch neuronale Proteine ​​steuernin ihrer natürlichen Umgebung, die optische Präparation neuronaler Prozesse und Mechanismen auf molekularer Ebene ermöglichen. In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur genetischen Einbau von UAAs in primäre Neuronen in der Kultur und in der embryonalen Gehirn der Maus in vivo. Die photoresponsive Uaa Cmn und Kir2.1 werden verwendet, um den Prozess zu veranschaulichen. Methoden erfolgreich Uaa Einbau und optische Kontrolle der neuronalen Proteinaktivität sind vorgesehen, um beurteilen zu können. Dieses Protokoll stellt eine klare Anleitung zur genetisch kodierend UAAs in Neuronen und in vivo und in optisch neuronale Proteinfunktion über eine auf Licht ansprechende Uaa regulieren. Wir erwarten , dass dieses Protokoll , um die Annahme der in vivo Uaa Technologie für Neurowissenschaften und optogenetische biologische Untersuchungen zu erleichtern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm</td>
			<td style="width:455px;">Carolina Biologicals</td>
			<td style="width:301px;">633029</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:455px;">Corning Discovery Labware</td>
			<td style="width:301px;">354210</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">G8769</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Iris Spatula-curved</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10092-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Dissecting Knife - Fine Angled Tip</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10056-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td style="width:455px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:301px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">MITO+ Serum Extender</td>
			<td style="width:455px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:301px;">355006</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:455px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:301px;">352340</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:301px;">BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">B6420</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">LED LIGHT SOURCE &#8211; Black LED 385</td>
			<td style="width:455px;">Prizmatix Ltd.</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td style="width:455px;">Promega</td>
			<td style="width:301px;">V2111</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Um genetisch eine Uaa in ein Protein in den Nervenzellen übernehmen, ist der erste wichtige Schritt ist, entsprechende Gen zu entwerfen die Gene zu liefern und zu exprimieren effizient in Neuronen. Es gibt drei genetische Komponenten für Uaa Einarbeitung: (1) das Ziel-Gen mit dem TAG amber Stop-Codon an der gewählten Stelle eingeführt für Uaa Einbau (2) eine orthogonale tRNA, die das mutierte TAG Stopcodon, und (3) eine orthogonale Aminoacyl zu erkennen -tRNA Synthetase die Uaa auf ...

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Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...